腎-骨髓聯合移植誘導免疫耐受患者外周血B淋巴細胞重構的動態特點及其意義

張麗鵬，榮春書，谷一鳴，傅耀文，高寶山

(1.吉林大學第一醫院泌尿系統疾病診治中心，吉林 長春 130021；2.長春中醫藥大學附屬醫院腦病科，吉林 長春 130021)

B淋巴細胞在器官移植領域具有重要作用。近年來B淋巴細胞在移植免疫耐受中所發揮的作用越來越受到關注。諸多研究[1-12]顯示在免疫耐受移植患者中存在獨特的B淋巴細胞標志。有研究[4,6]顯示：免疫耐受的移植患者部分免疫球蛋白輕鏈可變區的基因表達量明顯上升。既往多數針對腎移植免疫耐受的研究[1,4,7]顯示：其研究對象往往是因免疫抑制劑出現嚴重并發癥而被迫停用或免疫抑制劑不耐受的患者，故免疫耐受的準確時間窗很難捕捉，影響了相關研究的準確性。為進一步揭示B淋巴細胞在器官移植誘導免疫耐受中的重構動態及分布特點，本文作者以5例腎-骨髓聯合移植患者為研究對象，其中有3例患者成功達到免疫耐受，并完成免疫抑制劑的撤除[13-14]。此類患者由于是操控性免疫耐受，臨床治療的時點、預處理方案的應用、免疫抑制劑撤除的時點及免疫耐受建立的時點均有準確的記錄，為研究的一致性及準確性提供了保障。利用這些患者的標本，從細胞表型及基因序列分析方面研究腎-骨髓聯合移植患者外周血B淋巴細胞重構的特點，找出不同時點外周血優勢B淋巴細胞亞群。為進一步研究B淋巴細胞在器官移植免疫耐受建立中發揮的作用提供依據。

1　資料與方法

1.1研究對象診斷標準：各種腎臟疾病導致的不可逆的慢性腎臟功能衰竭。入選標準：年齡>18周歲，首次腎臟移植。排除標準：存在嚴重的心、肺疾病，存在活動性感染，嚴重的消化系統潰瘍，明顯的凝血功能異常，并發惡性腫瘤，需多器官移植，對免疫抑制劑不耐受。研究所用標本來自5例接受腎-骨髓聯合移植手術的患者。患者接受了人淋巴細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)半相合的腎-骨髓聯合移植，患者編碼分別為Pt.A、Pt.B、Pt.C、Pt.D和Pt.E。患者一般資料見表1。

1.2免疫誘導和免疫抑制方案術前7 d、2 d及術后5 d和12 d分別給予利妥昔單抗，375 mg·m-2；術前5 d及4 d環磷酰胺60 mg·kg-1靜脈注射；術前2 d抗CD2單克隆抗體0.1 mg·kg-1，移植當日(0 d)及術后1 d給予0.6 mg·kg-1；術前1 d胸腺放射線照射，700 cGy；手術當日(0 d)，行同種異體腎移植手術，輸供者骨髓細胞(2～8)×108kg-1；術前1 d開始他克莫司0.1 mg·kg-1·d-1口服，術后逐漸減量應用，至術后8個月時停用；醋酸潑尼松片自手術當日起2 mg·kg-1·d-1口服，至術后20 d停用。

1.3患者隨訪患者術后依據隨訪計劃定期隨訪，如少尿、發熱、移植腎區疼痛時隨時就診。因Pt.C術后6個月時移植腎功能喪夫終止隨訪外，其余患者隨訪時間為3.0～5.0年，平均隨訪時間為4.3年。

表1　5例患者的一般資料

FSGS：Focal segmental glomerular sclerosis; MPGN：Mesangial proliferative glomerular nephritis; “-”:No data..

1.4實驗方法外周血B淋巴細胞表型鑒定：外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)加入APC耦聯的抗CD19抗體(英國Becton Dickinson公司)、FITC耦聯的抗CD24抗體(美國BD Biosciences公司)、APC/Cy7耦聯的抗CD27抗體(美國Biolegend公司)、PE耦聯的抗CD38抗體(英國Becton Dickinson公司)，混勻細胞，于4℃避光靜置30 min，4℃ PBS洗滌2次后，應用FACSVerse流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)檢測細胞表面標志。B淋巴細胞數量以絕對值表示(個/μL)，B淋巴細胞所占比例以百分比(%)表示。重組免疫球蛋白重鏈可變區(immunoglobulin heavy chain variable region，IGHV)基因分析：從PBMC提取RNA，以RNA為模板合成cDNA，再以合成的cNDA作為模板，用6種分別針對IGHV 6個家族基因(VH1～VH6)的正向引物及共同的恒定反向引物(JH)行PCR。將各時點DNA產物充分混勻，DNA的濃度為10 mg·L-1，取100 μL樣本，干冰冷凍包裝，寄往Beckman-coulter Genomics Services行DNA序列檢測。

重組IGHV基因序列及體細胞突變分析：經檢測的IGHV應用免疫球蛋白分析軟件IgAT分析[15]。利用此軟件，每個基因序列中的框架區序列(FR1～FR3)以及互補決定區序列(CDR1～CDR3)均可被鑒別分析。利用基因序列中互補決定區序列3(complementarity determining region 3，CDR3)序列高度變異性的特性，如果諸多DNA序列中含有相同的CDR3序列，則認為這些DNA序列來源于同一個B淋巴細胞克隆，并據此分析B淋巴細胞的基因譜構成。同樣，IGHV的高頻體細胞突變(somatic hypermutation，SHM)也用IgAT分析軟件加以鑒別。計算體細胞突變比例以揭示不同時點外周血B淋巴細胞基因序列突變情況。計算香農指數(Shannon diversity index，SDI)，用以反映不同時點B淋巴細胞基因序列的多樣性分布。SDI越高，說明基因多樣性越強。

1.5患者預后Pt.C移植術后6個月時因血栓性微血管病移植腎功能喪失，該患者未納入后續研究。余下的4例患者，免疫抑制劑逐漸減量并于術后8個月停用。Pt.A、Pt.B和Pt.D移植術后4～5年時間內移植腎功能保持穩定。Pt.E停用免疫抑制劑后2個月時出現了急性T淋巴細胞介導的排異反應，重新應用免疫抑制劑，但該患者移植腎功能未恢復。

1.6統計學分析采用GraphPad Prism 5.0統計軟件進行統計學分析。組間IGHV基因序列的SDI比較采用Studentt檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1腎-骨髓聯合移植患者外周血B淋巴細胞的重構因入組患者移植術前及術后應用了利妥昔單抗，因此幾乎清除了外周血中所有B淋巴細胞。如圖1A所示，B淋巴細胞重構的動態變化在患者之間變異較大，Pt.A 的B淋巴細胞重構最早，Pt.B和Pt.D外周血B淋巴細胞重構相對較晚，而Pt.E外周血B淋巴細胞重構最晚，術后1年時外周血B淋巴細胞數量仍處于極低水平，此患者術后10個月時發生了移植腎排異反應。除了Pt.E外周血B淋巴細胞重構延遲外，Pt.A、Pt.B和Pt.D均在術后1年左右外周血B淋巴細胞計數基本恢復術前的水平(30～40 μL-1)。盡管患者術后早期外周血B淋巴細胞被完全清除，但術后182 d時點所有患者外周血中均檢測到少量B淋巴細胞。本文作者對不同時點每例患者的外周血B淋巴細胞進行了表型鑒定，如圖1B所示，術后182 d時，以表達CD19+CD24highCD38high為特征的過渡性B淋巴細胞總體來說比例非常低：182 d時，過渡性B淋巴細胞約占Pt.B外周血B淋巴細胞的5%，而Pt.A、Pt.D和Pt.E在這個時間點幾乎檢測不到過渡性B淋巴細胞。

相反，所有患者術后182 d的B淋巴細胞是以表達CD20+CD27+ 的記憶性B淋巴細胞為主，此時點的記憶性B淋巴細胞占外周血B淋巴細胞的60%～90%(圖1C)。這些記憶性B淋巴細胞很可能是逃脫B淋巴細胞清除劑利妥昔單抗后殘留下來的。此后時間點，記憶性B淋巴細胞的百分比快速下降至很低水平。

A: Absolute nubmer of B cells; B: Percentage of translational B lymphocytes; C: Percentage of memory B lymphocytes.

2.2腎-骨髓聯合移植患者外周血B淋巴細胞IGHV基因譜為了從細胞克隆水平評價患者外周血B淋巴細胞的重構特點，本文作者利用下一代基因測序手段從具有代表性的時點標本中獲得了2 500～28 500個可讀的基因序列，并分析所有基因序列中的CDR3片段，將具有相同CDR3片段的基因序列重新排列，獲得每個時點樣本B淋巴細胞基因序列的分布圖。如圖2～5(插頁六)所示，基因分布圖顯示了患者移植術后每個時點外周血B淋巴細胞的IGHV家族(VH1～VH6)CDR3序列的分布頻數。患者移植術前、術后364 d及728 d時B淋巴細胞基因圖譜呈多樣性分布。盡管在移植術后182 d時B淋巴細胞計數很低，但本文作者仍依靠此策略從每例患者的標本中獲得了足夠的B淋巴細胞IGHV基因序列以供分析。結果進一步證實移植術后182 d時確實有極少量特定亞群的B淋巴細胞仍存在于患者外周血中。而此時點的B淋巴細胞基因圖譜與其他時間點的圖譜具有很大差異，B淋巴細胞池中僅存在少量具有優勢分布的B淋巴細胞克隆。結合B淋巴細胞表型鑒定的結果綜合分析則進一步證實：此時點發現的外周血B淋巴細胞很可能是經利妥昔單抗誘導治療后殘存的記憶性B淋巴細胞。

2.3患者外周血B淋巴細胞IGHV基因序列的多樣性作為IGHV基因序列多樣性的直觀指標，本文作者計算了多時點基因序列的多樣性指數——SDI。結果顯示:所有患者在術后182 d時點IGHV基因序列的SDI明顯低于術前(P=0.004)，此指數在術后1年左右逐漸恢復。見圖6。

2.4外周血B淋巴細胞IGHV基因序列體細胞突變除了Pt.B，其他患者基因序列的體細胞突變率在術后182 d時點明顯升高(P=0.032)，對應了在此時間點上記憶性B淋巴細胞是外周血B淋巴細胞的優勢亞群。Pt.B是唯一在術后182 d時點檢出過渡性B淋巴細胞的患者，由于過渡性B淋巴細胞是幼稚細胞，因此該患者此時點的B淋巴細胞基因序列體細胞突變率呈下降趨勢。見圖7。

A:Pt.A；B：Pt.B；C：Pt.D；D：Pt.E.

A:Pt.A；B：Pt.B；C：Pt.D；D：Pt.E.

Somatic mutations (SHM) within IGHV sequences were identified using IgAT software. SHM rates were calculated for all time points. The total number of sequences analyzed for each sample was indicated below the time point markers.

圖7不同時間點患者外周血IGHV基因序列體細胞突變率分析

Fig.7Analysis of somatic mutation rates of sequences of IGHV in peripheral blood of patients at different time points

3　討　論

本研究檢測了腎-骨髓聯合移植并達到誘導免疫耐受患者B淋巴細胞的重構。這個臨床方案為本文作者提供了準確的研究時間窗，以便研究在免疫耐受誘導中B淋巴細胞的分布特性以及鑒別哪種特定B淋巴細胞亞群可能對潛在的免疫耐受機制發揮作用。

本研究結果顯示：腎-骨髓聯合移植后，患者外周血B淋巴細胞池逐漸恢復重構。在重構過程中，外周血B淋巴細胞計數個體之間差異很大，Pt.B的淋巴細胞重構較早，而Pt.A和Pt.D的B淋巴細胞重構相對較晚；Pt.E的B淋巴細胞重構最晚，此患者移植術后10個月時經歷了移植腎排異反應并應用糖皮質激素及抗胸腺細胞免疫球蛋白治療。細胞表型研究結果顯示：盡管器官移植早期外周血B淋巴細胞的絕對計數較低，但呈現出很高比例的表達CD27+的 B淋巴細胞。此細胞亞群很可能是利妥昔單抗處理后，未被清除的記憶性B淋巴細胞。由于記憶性B淋巴細胞與未成熟B淋巴細胞相比更易逃脫利妥昔單抗的清除。而在B淋巴細胞極度缺乏時，將出現B淋巴細胞的自適應增殖[16]，同時因記憶性B淋巴細胞的自適應增殖效率高于未成熟B淋巴細胞[17]，因此移植術后早期表現為以CD20+CD27+為優勢亞群的B淋巴細胞。腎移植術后相對較晚的時點，待免疫抑制劑撤除后，過渡性B淋巴細胞的比例及絕對值有較大的波動。第2代測序對所有4例患者術后6個月IGHV基因的分析發現B淋巴細胞的基因圖譜分布變化，恰好證實這一點。此時點IGHV基因的高頻率體細胞突變進一步證實這些細胞是分化的記憶性B淋巴細胞。盡管存在個體上的差異，但總體來說，移植術后1年時點，隨著新產生的未成熟過渡性B淋巴細胞的出現，整體外周血B淋巴細胞組成基本恢復術前狀態。這種B淋巴細胞組成的恢復同時伴隨有IGHV基因SDI的上升以及突變基因頻數的下降。

Blair等[18]研究發現：過渡性B淋巴細胞具有調節功能，尤其是通過分泌IL-10而實現。本研究及其他研究[1,4-5,7]均顯示：在免疫耐受患者中過渡性B淋巴細胞上升。盡管觀察到此現象，但仍不能能認為過渡性B淋巴細胞是一個關鍵的免疫耐受因素。傳統觀點認為：外周血中檢測到的過渡性B淋巴細胞尚未經歷抗原刺激，故不太可能在體內有確切的功能。然而，B淋巴細胞的調節功能需要持續的刺激、使之失去未成熟的表型才能實現。

當然，調節性B淋巴細胞在體內可以從過渡性B淋巴細胞分化而來，但調節性B淋巴細胞在分化過程中將失去未成熟的細胞表面標志。因此很難說外周血標本中檢測到的過渡性B淋巴細胞在免疫耐受中起到關鍵性的作用。相反，患者在免疫耐受誘導過程中，記憶性B淋巴細胞是主要的細胞亞群。以往的研究[1,4,7,19]也曾顯示記憶性B淋巴細胞的增加與誘導免疫耐受有關，由于這些研究的主要目標是觀察過渡性B淋巴細胞與免疫耐受的關系，因此這些結果并未得到足夠的重視。而且有研究[20-21]顯示：記憶性B淋巴細胞也具有免疫調節的作用。結合以往相關的研究結果本實驗結果表明：記憶性B淋巴細胞很可能在腎-骨髓聯合移植患者中參與免疫耐受。但在患者外周血中發現的過渡性B淋巴細胞在免疫耐受建立的時間點很可能并未發揮關鍵性作用[22]。

本研究利用腎-骨髓聯合移植患者的臨床標本及資料，充分發揮此類患者臨床干預及免疫耐受建立具有準確時間窗的優勢，從細胞表型及基因序列分析方面研究腎-骨髓聯合移植患者外周血B淋巴細胞重構的組成成分以及分布特點，找出不同時點的外周血優勢B淋巴細胞亞群，為進一步研究B淋巴細胞在器官移植免疫耐受建立中發揮的作用提供了依據。

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