多發性骨髓瘤和慢性淋巴細胞白血病患者血漿lncRNA MALAT1、LincRNA-p21和GAS5的表達水平及其診斷意義

黃　琦，沙　輝，陳　龍，呂龍龍，徐聲鳴，張澤天，趙　松，靳鳳艷，牛　豐

(1.吉林大學第一醫院脊柱外科，吉林 長春 130021；2. 吉林大學第一醫院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一種以骨組織局灶性、軟組織病變和彌漫性骨髓浸潤為主要病理特征的骨髓惡性B淋巴細胞疾病，多發于中老年人群，近年來其發病率出現了逐漸增高的趨勢。慢性淋巴細胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)是主要發生在中老年人群的一種成熟淋巴細胞克隆增殖性腫瘤，其特征為外周血、骨髓、脾臟和淋巴結等處的小淋巴細胞聚集。MM與CLL存在著相似的發病機制和演進過程，特別是當MM患者某種首發癥狀突出時，極易導致與CCL混淆，造成誤診[1-2]。因此，探討這2種疾病的分子生物學標志物的區別與聯系具有重要的臨床意義。近年來的研究[3-4]顯示：長鏈非編碼RNA(lncRNA)在腫瘤細胞基因表達的調控中發揮著重要的作用，很多種lncRNA在特定腫瘤中呈現特異性的表達，針對lncRNA在腫瘤的診斷、治療及預后評價中應用價值的研究已成為近年來的熱點問題。研究[3,5]顯示：lncRNA MALAT1、LincRNA-p21和GAS5的表達異常可能參與了MM和CLL的病理過程，但國內外目前缺乏將這3種lncRNA作為血液標志物用于MM臨床診斷的研究報道，基于這一研究現狀，本研究針對MM和CLL患者血漿lncRNA MALAT1、LincRNA-p21和GAS5的表達水平及其診斷意義進行檢測和分析，旨在闡明3種lncRNA在MM與CLL鑒別診斷中的意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2014年6月—2015年6月本院收治的60例MM患者(MM組)、60例CLL患者(CLL組)和60名健康體檢者(對照組)作為研究對象，MM組和CLL組患者均符合吳曉芝主編的《血液病診斷與鑒別診斷圖譜(2009年版)》[6]中的相關診斷標準，均表現為B細胞的克隆性增殖，患者均為首診病例且未接受過任何抗腫瘤治療；排除并發有活動性傳染性疾病、急慢性肝炎、其他種類惡性腫瘤、精神疾患、腦卒中、重要器官器質性病變及入組前1個月有嚴重創傷或手術史的患者。對照組研究對象均經各項臨床檢查排除血液系統惡性腫瘤、心肝腎等器官嚴重損害，各組研究對象的臨床資料見表1和2。所有納入研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書，本研究方案經本院醫院倫理委員會審核通過。

表1各組研究對象的臨床資料

Tab.1Clinical data of subjects in various groups

(n=60)

表2　MM組和CLL組患者臨床分期

“-”：No data.

1.2觀察指標和檢測方法采集各組研究對象的空腹外周靜脈血標本，分離血漿后采用Tripure分離試劑(德國Roche公司)提取血漿總RNA，提取過程按照生產商的產品推薦流程進行，提取物保存于-80℃的冰箱中待測，根據生產商的推薦采用第一鏈基因cDNA合成試劑盒(美國Themo Scientific公司)、LightCyler 480實時定量PCR儀(德國Roche公司)對血漿標本中的lncRNA MALAT1、LincRNA-p21和GAS5進行擴增和定量檢測，以cel-miR-39為內參，初始熱啟動為10 min，經45個周期的擴增，每個周期包括變性(10 s、95℃)、退火(60℃、20 s)，擴增(72℃、30 s)等過程，目的lncRNA的引物序列見表3。讀取目的lncRNA及內參的循環閾值(Ct值)，并計算目的lncRNA 與cel-miR-39的Ct 值差值(△Ct)，以2-△△Ct的數值代表目的lncRNA的相對表達水平。

表3　目的lncRNA引物序列

1.3統計學分析應用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。由于目的lncRNA相對表達水平不服從正態分布，故采用中位數+四分位數(M，Q1，Q3)的形式表示，多組間比較采用多組計量數據的秩和檢驗(Kruskal-Wallis H法)，兩兩比較采用Mann-Whitney U法，應用Bonferroni法調整檢驗水準，目的lncRNA在CLL和MM診斷中的價值應用受試者工作特征曲線(ROC曲線)進行分析，以ROC曲線下面積(AUC)作為評價診斷價值的指標，取約登指數最大時為最佳篩選界值(Cutoff值)。以P<0.05為差異有統計學意義(Bonferroni法調整后檢驗水準為0.017)。

2　結　果

2.1各組研究對象血漿目的lncRNA相對表達水平各組研究對象血漿目的lncRNA相對表達水平比較差異均有統計學意義(χ2=71.903、47.212、45.822，P<0.05)；MM組患者血漿lncRNA MALAT1和GAS5相對表達水平明顯高于其他2組(P<0.05)，CLL組患者血漿LincRNA-p21相對表達水平明顯低于其他2組(P<0.05)；CLL組與對照組研究對象血漿lncRNA MALAT1和GAS5相對表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；MM組與對照組研究對象血漿LincRNA-p21相對表達水平比較差異亦無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4　各組研究對象血漿目的lncRNA相對表達水平

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with CLL group.

2.2目的lncRNA在MM和CLL診斷中的價值ROC曲線分析顯示：在剔除CLL組患者后，MM組患者血漿lncRNA MALAT1和GAS5的 AUC分別為0.898和0.815，95% 置信區間(CI)分別為0.836～0.959和0.740～0.890，與對角線下面積0.5(對照組)比較差異均有統計學意義(P<0.05)，說明lncRNA MALAT1和GAS5對于MM有診斷價值；而LincRNA-p21對于MM無診斷價值(P>0.05)。見表5和圖1。在剔除MM組患者后，CLL組患者血漿LincRNA-p21 AUC為0.850，95% CI為0.780～0.921，與對角線下面積0.5(對照組)比較差異有統計學意義(P<0.05)，說明LincRNA-p21對于CLL有診斷價值；而lncRNA MALAT1和GAS5 對于CLL無診斷價值(P>0.05)。見表6和圖2。

表5　目的lncRNA在MM診斷中的價值分析

“-”:No data.

A:MALAT1； B:LincRNA-p21； C:GAS5.

表6　目的lncRNA 在CLL診斷中的價值分析

“-”:No data.

A:MALAT1； B:LincRNA-p21； C:GAS5.

2.3目的lncRNA在CLL和MM鑒別診斷中的價值在剔除對照組研究對象后，以CLL組患者為對照病例進行ROC曲線分析，結果顯示：MM組患者血漿lncRNA MALAT1、LincRNA-p21和GAS5的AUC分別為0.878、0.778和0.805，95% CI分別為0.814～0.942、0.691～0.865和0.727～0.882，與CLL組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，說明其對MM和CLL的鑒別診斷均有價值。見表7和圖3。

表7　 目的lncRNA在MM和CLL鑒別診斷中的價值分析

A:MALAT1; B:LincRNA-p21; C:GAS5.

3　討　論

在人類的基因組中，編碼蛋白質基因僅占2%，多達70%的人類基因只被轉錄成RNA，故人類基因組包含更多的非編碼RNA信息，在RNA轉錄本中，除了經典的rRNA和tRNA等“看家”RNA和最近發現并明確定義的微小RNA(microRNAs, miRNAs)外，還包括lncRNA，其長度超過200個核苷酸并具有高度的保守性。目前的研究[5，7]已證實：哺乳動物的基因組能夠編碼產生1 000多種lncRNA，在人類基因組中已發現了5 446個lncRNA相關基因。每種lncRNA均具有一定的結構和生化特性，能夠參與細胞核結構和基因表達調控、免疫監視、胚胎干細胞的功能發育等多種生物學過程。研究[3,8]顯示：lncRNA參與腫瘤的發病和進展過程，但這些lncRNA對腫瘤細胞的影響機制并不十分清楚。腫瘤細胞和組織中RNA表達水平具有一定的不穩定性，而且取材較為困難，相比之下，非細胞系統的循環RNA表達水平相對穩定，特別是血漿或血清中RNA檢測數據的可重復性更高。雖然目前針對外周循環中tRNA和miRNA表達量的研究較多，而對于循環lncRNA與腫瘤相關性的研究較少，但血液中游離的lncRNA是對于B淋巴細胞性惡性腫瘤具有重要意義的生物學標志物。

研究[8]顯示：血液疾病患者的基因異常表達可通過多個相互作用的途徑對骨髓瘤細胞、骨髓細胞外基質蛋白和基質細胞表面受體產生影響，從而參與腫瘤的生長、存活、遷移和耐藥。本研究選取MALAT1、LincRNA-p21和GAS5作為目的lncRNA，其中，LincRNA-p21被認為是一種具有抑癌活性的lncRNA，LincRNA-p21的命名源于其是鄰近p21基因的1個轉錄抑制因子，能夠形成1個復雜并互相作用的RNA復合物，參與抑制腫瘤細胞抑制P53蛋白過程[9]。GAS5作為一種生長抑制特異基因，可對糖皮質激素及其受體發揮抑制作用并對淋巴和乳腺細胞的存活發揮調節作用[10-11]。目前的研究[12-13]已證實：GAS5與前列腺癌、腎細胞癌和非小細胞肺癌等惡性腫瘤的發生和發展均有相關性。MALAT1是轉移相關肺腺癌基因1的基因符號，已被證明在中樞神經系統、內分泌系統、免疫系統、生殖系統和淋巴系統等多種組織系統中表達，MALAT1主要在細胞核內表達并對其基因的表達發揮調控作用[14-15]。MALAT1能夠在細胞周期的選擇性剪接調控中發揮作用，研究[16-17]已證實：MALAT1的過表達與發生在肺、結腸和膀胱等處實體腫瘤的發生具有相關性。

本研究結果顯示：MM患者血漿lncRNA MALAT1和GAS5相對表達水平較高，提示血漿lncRNA MALAT1和GAS5的高表達與MM的發病有關，而血漿LincRNA-p21的低表達則與CLL的發病有關，檢測上述3種lncRNA的血漿相對表達水平在MM和CLL診斷中具有重要的價值，可作為臨床診斷的輔助指標。在本研究中嘗試性地計算出3種lnRNA在診斷MM、CLL及MM與CLL鑒別診斷中的Cutoff值，可供進一步研究作為參考。眾所周知，p53基因缺失是與MM和CLL等血液系統疾病的發病高度相關的事件，而LincRNA-p21的低表達可導致對p53抑制基因的作用下降，且其下調水平與CLL的疾病分期也具有相關性，這與17p13缺失與CLL的相關性具有一致性[18]。而GAS5和MALAT1的高表達則可對MM的發病發揮促進作用，GAS5的上調可對細胞凋亡發揮抑制作用，使細胞保持更多的細胞周期，而降低MM腫瘤細胞的GAS5表達可提升對于化療藥物的敏感性，白血病細胞的GAS5表達水平也可作為預測淋巴細胞存活率的指標[19]。研究[20]顯示：在CLL和MM患者外周血中GAS5表達水平降低，這有待于進一步的研究予以討論和證實。MALAT1具有一定的組織特異性， MALAT1在B細胞惡性腫瘤組織中的表達水平低于在實體瘤中的表達水平，但很多實體瘤患者外周循環中的MALAT1表達水平并不呈現明顯的上調[21]。循環MALAT1與B細胞惡性腫瘤的轉移和復發具有更加密切的聯系，MM患者血漿MALAT1的高表達可能發揮干擾骨髓微環境、促進骨髓腫瘤細胞的增殖等作用[20, 22-24]，但其詳細機制還有待進一步的研究。

綜上所述，血漿lncRNA MALAT1和GAS5的高表達與MM的發病有關，而血漿LincRNA-p21的低表達與CLL的發病有關，上述3種lncRNA的血漿相對表達水平可作為MM和CLL診斷的輔助指標。

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