淫羊藿苷/載明膠納米復合物-PLGA緩釋系統的制備及工藝優化

宋效慶,劉　紅,陳天杰,劉稱稱,路政寬,秦　爽,黃　山

(吉林大學口腔醫院綜合治療科，吉林 長春 130021)

先天畸形、外傷、感染及手術所導致的骨缺損患者日益增多，且臨床修復難度較大，對患者的身心健康構成了嚴重威脅，已經成為極其嚴重的公共健康問題[1]。近年來，中醫藥治療骨缺損方面顯示出巨大優勢，尤其是單味中藥有效成分具有選擇性高、針對性強的特點。在眾多中藥提取的有效成分的對比研究中，淫羊藿苷(icariin,ICA)具有顯著的成骨效能，被認為是最具潛力的促進骨修復的天然藥物之一[2-3]。

但ICA較低的生物利用率和短的半衰期限制了其臨床應用。將ICA載入緩釋體系，提高其生物利用率是目前較為熱門的研究課題[4]。聚合物載體系統可以保護藥物免于降解，并在藥物釋放的靶點提供一個預先設計的方式給藥，獲得更好的療效，同時排除了過高和過低給藥的可能。 明膠是一種從膠原中提取的水溶性大分子鏈，明膠本身具有大量的氨基和羧基，并且可以通過pH值的調節改變其表面電勢[5]，是一種良好的載體和保護劑，明膠納米微球用于載藥研究已近三十年，并首先應用于小相對分子質量藥物的載體[6]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid,PLGA]是一種高分子聚合物，是被美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)認證的生物載體材料，其具有良好的生物相容性和可降解性。納米-微球系統是新型的載藥體系，在體內、體外實驗中均取得了較為理想的結果。目前，已有學者[7-9]將PLGA、脂質體和殼聚糖包封于PLGA微球中，形成復合載藥體系，但尚未見有關明膠PLGA復合微球載藥系統的相關報道。本研究利用S/O/W法[10]制備一種新型緩釋系統。這種方法是基于制備出具有吸附作用的明膠納米粒(gelatin nanoparticles,GNPs)[11]，ICA通過氫鍵結合于納米粒的表面，形成無特定相對分子質量的納米復合物，納米復合物可以與可降解的控釋聚合物兼容，容易被PLGA聚合物包封。本研究對載體系統的設計、物理化學特性和釋放特點進行檢測,并優化制備工藝。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器PLGA(50∶50 PLGA, 相對分子質量為30 000～60 000)、 聚乙烯醇(PVA)和A 型明膠(美國Sigma公司);二氯甲烷(CH2Cl2)和分析純(中國北京化工廠)；丙酮、無水乙醇和50%戊二醛(中國天津市廣成試劑有限公司，均為分析純)。熒光倒置顯微鏡和光學顯微鏡(日本Olympus公司)，CO2恒溫細胞培養箱(日本SANYO公司)，臺式高速離 心 機(德國Eppendorf公司)，JB-2型 恒 溫磁力攪拌器(中國上 海 雷 磁新涇儀器有限公司)，KQ-100DA型超聲儀(中國昆山市超聲儀器有限公司)，高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，掃描電子顯微鏡(SEM)(日本 Hitachi公司)，納米粒度點位分析儀(美國Zeta PALS公司)，普通臺式離心機(中國上海安亭離心機械廠)，JB-2 型恒溫磁力攪拌器(中國上海雷磁新涇儀器有限公司)

1.2 ICA納米復合物的制備GNPs的制備使用二步去溶劑法[11-12]。取500 mg明膠加入到10 mL去離子水中，加熱溶解制成明膠水溶液；再向明膠水溶液中加入10 mL丙酮，獲得沉淀的明膠200～300 mg，然后用10 mL去離子水再次溶解，得到明膠水溶液，并將溶液的pH值調整為2.5～4.0；在500～1 000 r·min-1磁力攪拌下將30～40 mL丙酮逐滴加入得到的明膠水溶液中，使體系乳化，然后立即向上述體系中加入40 μL、質量分數為50%的戊二醛水溶液，40℃繼續攪拌1 h，再將乳液室溫靜置8 h使GNPs固化，得到GNPs懸浮液,置于4℃冰箱冷藏；取2 mL上述溶液，去離子水清洗沉淀3～5次，向最后所得的沉淀中加入1 mL去離子水，得到6 g·L-1GNPs保存液，再加入1 g·L-1ICA的甲醇儲備液1 mL，然后于恒溫箱25℃內共混24 h，將得到的乳液離心，去上清，加入0.5 mL的去離子水溶液，超聲5～10 min,得到吸附ICA的GNPs混懸液。

1.3 ICA@GNPs-PLGA復合微球的制備將得到的吸附ICA的GNPs混懸液加入到1.5 mL PLGA(質量分數為0.25%～2.00%)的CH2Cl2溶液中，超聲5～10 min，形成S/O混合相；形成的S/O混合相中緩慢滴入15～20 mL、質量分數為2%的聚乙烯醇(PVA)水溶液，滴加的速度為1～2 mL·min-1，然后于1 000～2 000 r·min-1下攪拌4 h，5 000 r·min-1離心，離心產物用去離子水洗滌3～4次，凍干，最后于4℃冰箱冷藏，從而得到所述的載ICA的PLGA-明膠復合微球。

1.4 GNPs和ICA@GNPs-PLGA微球表征的觀測GNPs的尺寸和形貌利用SEM觀測，去離子水洗滌 3 次，離心 15 min 后濃縮，樣品凍干，得到GNPs粉末，置于硅片上，真空下噴金2 nm。PLGA的尺寸和形貌利用SEM觀測，方法同上。使用 Nano measurer 1.2 軟件計算粒徑分布范圍。

1.5 ICA標準曲線的繪制色譜條件及樣品制備：高效液相色譜法(high performance liquid chromatography， HPLC)檢測方法為內標法[13]。色譜柱：Zorbax SB-C18 HPLC column (5 μm,4.6,150 mm)；流動相：-55%A+45%D (A: H2O+0.2% H3PO4, D: 甲醇)；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30.0℃；進樣量：10 μL。將ICA明膠納米復合物的水溶液恒溫震蕩分散2 h后，取500 μL溶液，10 000 r·min-1離心5 min后，再用微孔濾膜濾過，得樣品溶液。標準曲線的制作：精確量取ICA甲醇溶液對照樣品溶液1.0 mL，加水稀釋成濃度分別為1、3、7、10、30、50和70 mg·L-1的水溶液，依次取10 μL 注入高效液相色譜儀內，按上述色譜條件測定色譜峰面積，以樣品濃度(mg·L-1)為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到回歸方程。

1.6納米粒復合物中ICA吸附量的檢測將0.5 mL納米復合物儲備液加入去離子水，補液至10 mL，超聲5 min，離心，測量上清液中ICA的濃度，后收集GNPs再次分散，重復2次，采用HPLC測試染料木素的含量，將3次結果相加得到染料木素的含量。HPLC檢測條件同上。按以下公式計算吸附率：吸附率=[N1(上清液藥物含量)+N2(上清液藥物含量)+ N3(上清液藥物含量)]/初始投入量×100%(N為離心的次數)。

1.7藥物體外釋放規律和載藥量觀察檢測所用微球制備條件同表1中微球7。稱取10 mg制備的復合微球分為3份，置于裝有40 mL PBS的試管中。在37℃條件下，將試管放入恒溫搖床中震蕩，轉速為100 r·min-1，隨著明膠的溶脹，ICA逐漸被釋放出來，每隔一段時間取緩釋液500 μL，并同時補充500 μL生理鹽水到釋放體系中，HPLC條件同上。按以下公式計包封率(entrapment efficiency，EE)：EE= (微球中藥物含量/初始投藥量)×100%；按以下公式計算載藥量(drug loading,DL)：DL=(微球中藥物含量/微球總質量)×100%。

2　結　果

2.1 GNPs和載藥微球的形態冷凍干燥后的GNPs外觀呈白色或淡黃色，大小均一，微球的粒徑為150～200 nm。冷凍干燥后得到的載藥微球為白色粉末狀，在室溫下放置穩定，分散性良好。SEM觀察：載藥微球的球形度較好、表面光滑、分散性良好，微球的粒徑為4～12 μm。見圖1。

圖1　GNPs(A)和載藥微球(B)的表面形貌

Fig.1Surface morphology of GNPs (A) and microspheres(B)

2.2ICA的標準曲線采用HPLC對不同濃度的ICA進行吸光度(A)值的測定，得到其線性回歸方程為：y=22 170x+51.092,R2=0.987 8。

2.3 ICA@GNPs-PLGA復合微球的優化當PLGA與明膠的質量比為5∶2時，形成的復合微球的比例達到100%；當PLGA與明膠的質量比超過5∶2時，復合微球的制備過程中出現大量的明膠碎片。復合微球的形貌特征由核心球的大小、PLGA與明膠的質量比和轉速決定。轉速為2 000 r·min-1時，復合微球的均一性優于1 000 r·min-1，轉速超過2 000 r·min-1時，制備出的復合微球乳液中出現大量的明膠團塊狀沉淀，完全復合微球形成比例也明顯下降。見表1。

2.4 GNPs對ICA的吸附量當溫度超過25℃、時間超過24 h、GNPs的濃度超過6 g·L-1時，GNPs對ICA的吸附量超過90%;當溫度超過33℃時，GNPs對ICA的吸附量下降至77%;繼續升高溫度達到37℃時，明膠對ICA的吸附量低于65%。

表1　在不同條件下制備的ICA@GNPs-PLGA復合微球

2.5 ICA@GNPs-PLGA復合微球EE和DLPLGA微球的載藥量取決于GNPs對藥物的吸附量，在復合微球可以完全包封GNPs的范圍內，復合微球的DL與明膠對藥物的吸附能力呈正相關關系(P<0.05)。同時ICA投入量與PLGA的EE呈負相關關系(P<0.05)。見圖2。ICA@GNPs-PLGA微球的EE高于(62.00±1.25)%。核殼比為5∶2時，復合微球的DL最高，約為13.7%，當超過一比例和低于這一比例復合微球的DL均會下降。

CM:Total content of drug in microsphere;C∑-C:Adsorbing capacity of drug in GNPs;I:ICA.

圖2ICA的EE和ICA投入量的關系

Fig.2Relationship between EE of ICA and quality of ICA added

2.6ICA@GNPs-PLGA復合微球體外釋放曲線PLGA微球的釋放從2 h到40 d,累積釋放率為65.21%。釋放特征顯示出較小的突釋, 24 h內微球累積釋放率低于5.47%,由于藥物的溶解和分散于微球的表面，隨后藥物的持續釋放周期超過25 d。見圖3。

圖3　ICA@GNPs-PLGA復合微球體外釋放曲線

Fig.3 Release curve of ICA@GNPs-PLGA composite microspheres in vitro

3　討　論

目前，治療缺損的藥物主要有基礎性用藥、骨吸收抑制劑、骨形成促進劑和混合制劑四類, 雖然二膦酸鹽和降鈣素等藥物在治療骨缺損方面經臨床證實療效顯著，但其昂貴的價格和可能引起的一系列并發癥限制了其臨床應用[14]。ICA是從淫羊藿中提取出來的一種異戊烯基黃酮醇苷，具有親水特性，大量研究[15-17]表明：ICA通過骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)通路、Wnt-β-Catenin通路、MAPK通路和Runx2、Osterix 2個蛋白節點調控間充質干細胞向成骨方向分化。傳統中醫認為ICA具有強筋健骨，補腎助陽的作用，取材方便且價格低廉。動物實驗結果顯示：ICA的藥理活性濃度為1×10-8～1×10-5mol·L-1,總體來看,1×10-8～1×10-5mol·L-1應該是ICA發揮其最佳藥理活性可能出現的區間，當濃度超過這一區間，ICA組破骨細胞凋亡率均明顯升高, 骨吸收陷窩數目、面積明顯減少，其抑制作用隨濃度增加而增強。故ICA的濃度和作用時間對于骨修復至關重要。工藝優化的主要考察指標是EE，制備完全包封ICA的納米復合物的緩釋微球是提高EE的關鍵。此外，復合微球的制備使用S/O/W溶劑蒸發法，不同于W/O/W 蒸發法，S/O/W溶劑蒸發技術制備的微球顯示出相對較高的EE，這種技術已經成功地用于制備出包封多種藥物復合微球[18]。考慮到ICA為針狀晶體粉末及其在水溶液和有機溶劑中的有限溶解度，本實驗首先將ICA吸附于GNPs表面，然后使用S/O/W溶劑蒸發技術制備微球。PLGA的類型是其成球性最重要的影響因素[19]，出于最佳的成球性、EE與釋放特征，本實驗選用50∶50的PLGA。

復合微球的制備實驗以PLGA的濃度、PLGA和明膠的質量比以及GNPs的投入量為自變量，以微球的粒徑和是否完全包封為因變量。PLGA的濃度設定為0.25%、0.50%、1.00%和2.00%，明膠的添加質量為12、6和3 mg，為提高藥物的EE，保證GNPs的形態不被破壞，轉速設定為2 000 r·min-1以下，當GNPs的質量為6 mg時，PLGA在DCM中的臨界濃度為0.5% ～1.0%；當GNPs的質量上升至12 mg時，PLGA在DCM中的臨界濃度升至1.0%～2.0%。當PLGA的濃度低于0.25%時，無完全包封的復合微球形成。同時，ICA的投入量和微球DL呈反比。攪拌速率和PVA的濃度未顯示出對DL的影響，所得到的數據差異可以被歸類于實驗的操作誤差。本實驗釋放檢測結果顯示：在臨界范圍內制備的緩釋微球，不僅可以提高ICA的DL，同時大幅提高其載藥量，克服了PLGA微球降解初期的突釋現象，長時間維持藥物的有效濃度，間接降低了不良反應，為骨缺損的表面改性涂層提供了一個全新的思路。

綜上所述，本研究在優化條件下制備了DL較高、粒徑較為均一的 ICA@GNPs-PLGA微球，且經過重復性實驗驗證后，證明該緩釋體系形態良好、粒徑分布范圍較窄、可重復性好；同時在體外實驗中這種復合微球克服了前期突釋，釋放時間超過40 d，本實驗對緩釋體系的理性性質進了評價。未來本文作者將利用細胞學、分子生物學及動物實驗全面、系統地評價緩釋體系的生物活性及其臨床應用的可行性。

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