IgE高親和力受體蛋白的制備及其生物功能的鑒定

徐 婷，張 強，喻荷蓮，王世春，徐小敏，易中梅，蔣天倫

(陸軍軍醫大學西南醫院輸血科，重慶 400038)

過敏性疾病常表現為支氣管哮喘、過敏性鼻炎和過敏性皮膚病等，對患者的日常生活質量有極大影響，嚴重時可危及生命，且這類疾病多由特異性IgE抗體介導的Ⅰ型超敏反應所引起[1-3]。當Ⅰ型超敏反應啟動時，IgE抗體結合于其高親和力受體α段(alpha segment of high affinity IgE receptor,FcεRIα)上，IgE- FcεRIα的交聯分子可促使肥大細胞脫顆粒并釋放血管活性物質，從而引起過敏反應[4-5]。研究表明，FcεRIα 蛋白在IgE介導的過敏性疾病的發生中占有重要地位[6-8]。因此，本研究通過基因工程技術制備FcεRIα 蛋白并對其生物學功能進行鑒定，為后續進一步探討FcεRIα在過敏性疾病中的作用奠定研究基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究經醫院倫理學委員會批準，患者知情同意，從本院收集健康人和慢性蕁麻疹(chronic urticaria,CU)患者標本各30例，健康人為對照組，CU患者為觀察組。原核載體pET-28a(+)、TOP10菌株、Arcticexpress 表達菌株均購自南京鐘鼎生物技術有限公司；DNA純化試劑盒、質粒提取試劑盒購自美國Axygen公司；限制性內切酶、DNA聚合酶均購自日本Takara公司；Ni2+IDA親和層析膠購自美國Novagen公司；小鼠抗人IgE單克隆抗體、HRP標記的山羊抗人IgG、HRP標記的山羊抗鼠IgG 單克隆抗體均購自英國Abcam公司；3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

臺式高速離心機購自德國Sorval公司；Biologic LP層析系統、Mini Protean Ⅱ垂直平板電泳系統、Gel Doc2000成像系統、水平電泳系統均購自美國BIO-RAD公司；PTC-200基因擴增儀購自美國MJ Research公司；Hofer ΜV-25紫外透射儀購自美國Amersham Pharmacia公司；JY92-2D超聲波細胞粉碎機購自中國新芝科技研究所；Multiskan MK3酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2方法

1.2.1人FcεRIα基因的擴增 根據Gene Bank中人的FcεRIα mRNA序列(NM_002001.2)，采用基于PCR的精確合成法(PCR-based accurate synthesis，PAS)的方法設計全長拼接引物合成基因FcεRIα，并在引物的上下游分別引入Nco Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點。引物序列如下：P1 上游引物為5′-TGT TTA ACT TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG GGC ATG GTC CCT CAG AAA CCT AAG G-3′;P2 下游引物為5′-AGC CGG ATC TCA GTG GTG GTG GTG GTT GCT CGA GTT GTA GCC AGT ACT TCT CA-3′。反應條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.2人FcεRIα重組表達質粒pET-FcεRIα的構建和鑒定 將人FcεRIα基因經Nco Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切處理后連接至原核載體pET-28a(+)，將重組質粒轉入TOP10克隆菌株，挑取陽性克隆子經Xba Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切鑒定正確后，送往上海生工公司測序。

1.2.3人FcεRIα的誘導表達 將質粒pET-28a(+)、pET-FcεRIα均轉化至Arctic Express感受態細胞中。吸取1 mL菌液為誘導前對照，在剩余菌液中加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，使其終濃度為0.5 mmol/L，11 ℃ 220 r/min振搖過夜，誘導蛋白表達。誘導后的菌液離心10 min，棄上清液，用PBS重懸菌體沉淀，后用超聲波破碎細菌，分別收集上清液與沉淀液中的蛋白樣品于12% SDS-PAGE檢測分析。

1.2.4人FcεRIα包涵體蛋白的復性及純化 收集菌體超聲破碎后的沉淀，用包涵體洗滌液(20 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，2 mol/L 尿素，1 mol/L NaCl，1% Triton X-100，pH 8.0)洗滌包涵體3次；用溶解緩沖液(20 mmol/L Tris，5 mmol/L DTT，8 mmol/L 尿素， pH 8.0)溶解包涵體，4 ℃放置過夜，于15 000 r/min 室溫離心15 min；將上述溶液滴加至透析緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)中，逐步成倍梯度稀釋緩慢攪拌，將蛋白溶液裝入透析袋于透析溶液中透析過夜。將包涵體溶液以0.5 mL/min流速上樣至Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱中，利用低壓層析系統對重組蛋白進行純化，并采用12% SDS-PAGE檢測分析。

1.2.5ELISA檢測人血清中抗FcεRIα自身抗體的水平 將重組FcεRIα 40 ng/mL 100 μL包被于ELISA 板上，4 ℃過夜并封閉，于板孔中加入1∶100 稀釋的對照組和觀察組血清標本，37 ℃孵育30 min；加入HRP 標記的山羊抗人IgG(1∶5 000) ，37 ℃ 孵育30 min；洗板后，每孔加入TMB 顯色液100 μL，于37 ℃避光顯色20 min，加入50 μL H2SO4(2 mol/L) ，于20 min內測定吸光度(A)值。

1.2.6ELISA檢測鑒定人FcεRIα重組蛋白與人血清中IgE的結合力 將重組FcεRIα 100 μL 包被于ELISA 板上，包被濃度分別設置為0、10、20、30、40、50、60 ng/mL，4 ℃過夜并封閉，于板孔中分別加入PBS(PBS組)、1∶100 稀釋的對照組和觀察組血清標本，37 ℃孵育30 min；加入100 μL 小鼠抗人IgE(1∶1 000) ，具體操作步驟同上。

1.3統計學處理 應用SPSS16.0 統計軟件進行數據分析，組間差異采用單因素方差分析的SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1人 FcεRIα 基因的擴增

2.1.1人FcεRIα基因的PCR擴增 設計全長拼接引物，通過基于PAS的方法獲得FcεRIα 胞外區段基因，經核酸電泳顯示目的基因大小約為560 bp，見圖1。

M:DNA分子量標記物

圖1人FcεRIα基因合成產物電泳圖

2.1.2重組質粒pET-FcεRIα的酶切鑒定 采用限制性內切酶Xba Ⅰ/Xho Ⅰ對重組質粒pET-FcεRIα進行雙酶切，電泳條帶大小約為5 300 bp 和600 bp，見圖2。

M:DNA分子量標記物；1：酶切前的重組質粒；2：酶切后的重組質粒

圖2重組質粒pET-FcεRIα的雙酶切鑒定

2.1.3陽性克隆子的測序結果 測序結果與GenBank中FcεRIα 的序列通過BLAST 軟件進行比對，結果顯示陽性克隆子的序列與原始序列一致。

2.2人FcεRIα 的誘導表達、復性及純化

2.2.1人FcεRIα的誘導表達 SDS-PAGE結果顯示，重組質粒pET-FcεRIα在原核表達宿主Arctic Express菌株中，誘導條件溫度為11 ℃、IPTG 濃度為0.5 mmol/L、振搖轉速為220 r/min過夜后，有相對分子質量約22 000大小的較濃條帶出現，大小與預期蛋白相對分子質量一致，而在無誘導條件中則無條帶出現。但是，從圖3中可以發現，目標蛋白主要集中在誘導表達的菌體裂解后的沉淀中。

2.2.2人FcεRIα的復性及純化 SDS-PAGE分析蛋白相對分子質量大小約為22 000(圖4)，純化后的蛋白濃度明顯高于未純化前。

2.3人FcεRIα的生物功能的鑒定

2.3.1人血清中抗FcεRIα自身抗體水平的測定 對照組中抗FcεRIα自身抗體濃度為(2.19±0.48)ng/mL,觀察組中抗FcεRIα自身抗體濃度為(13.65±1.64)ng/mL,觀察組血清中的抗FcεRIα自身抗體濃度明顯高于對照組(P<0.05)。

M:蛋白分子量標記物；1：重組質粒未誘導的表達產物；2：重組質粒誘導表達的可溶性產物；3：誘導表達的菌體裂解后上清液；4：誘導表達的菌體裂解后沉淀液

圖3人FcεRIα誘導表達的SDS-PAGE分析

2.3.2人FcεRIα重組蛋白與人血清中IgE的結合力測定 將不同濃度的重組人FcεRIα分別包被于ELISA板，隨包被蛋白量的增加，A值逐漸增大。當包被量繼續增加時，A值不再繼續增大。在包被蛋白量相同的條件下，觀察組血清的A值均大于對照組(P<0.05，表1)。PBS組A值小于0.1，由此能判斷重組的人FcεRIα可與人血清中的IgE 結合，見表1。

M:蛋白分子量標記物；1：未純化的表達產物；2：穿透液；3：洗脫液

圖4 人FcεRIα復性及純化的SDS-PAGE分析表1 各組不同濃度人FcεRIα重組蛋白與血清中IgE結合的A值比較

a：P<0.05，與對照組比較

3 討 論

本研究利用pET原核表達系統在體外成功制備了人FcεRIα蛋白并對重組蛋白的生物學功能進行了鑒定。結果表明，通過pET-28a(+)質粒克隆表達出的重組人FcεRIα蛋白能夠有效地檢測慢性蕁麻疹患者血清中的抗FcεRIα抗體水平，并且能夠與人血清中的IgE結合。本研究中的原核表達系統采用的是T7啟動子，該啟動子可調控目的基因的高效表達，同時在目的蛋白中融合His標簽，有便于表達后的親和純化。實驗采用低誘導溫度(11 ℃)和低IPTG濃度(0.5 mmol/L)，通過減慢蛋白合成速率，從而改變多肽折疊的動力學，進一步增加蛋白的正確折疊，為重組蛋白的正確表達提供了更有利的條件。

FcεRI是一個異四聚體結構，具有一條α鏈，一條β鏈，兩條γ鏈，膜外區α鏈是IgE的結合部位，也是觸發過敏反應的基本單位[9]。當多價抗原與IgE交聯時，受體即發生微聚集而被激活，經過蛋白激酶活化、磷脂酰肌醇水解及鈣離子流動等信號轉導過程，使肥大細胞、嗜堿粒細胞發生釋放炎性介質、分泌細胞因子及表達黏附分子等生物學反應，參與過敏性炎癥的形成，從而引起過敏反應。在此過程中發現，當血清中IgE水平上升時，細胞表面的FcεRI表達也出現上調現象[5,10]。因此，由IgE-FcεRI介導的肥大細胞和嗜堿粒細胞活化被認為是速發性過敏反應的一個重要標志。近年來，關于IgE在過敏反應中的介導作用已逐漸清楚，越來越多的研究更多集中在FcεRIα上，尤其是在由抗FcεRIα自身抗體所引起的自身免疫性蕁麻疹等疾病的研究中[11]。

在體外實驗中，將自身免疫性蕁麻疹患者血清與重組FcεRIα胞外區一起孵育，可抑制組胺釋放，提示抗FcεRIα自身抗體結合的表位位于FcεRI的α鏈上。這種針對FcεRIα的自身抗體作為致病因子存在于約12%～30%的慢性蕁麻疹患者血清中，并且這種自身抗體在自身免疫性慢性蕁麻疹發病機制中具有重要作用[12-13]。在經典的Ⅰ型過敏反應中，抗原與結合于FcεRI上的IgE發生交聯，激活信號傳導系統，導致效應細胞脫顆粒而發生過敏，但在自身免疫性慢性蕁麻疹中，IgG-抗IgE自身抗體與結合在FcεRI上的IgE發生交聯，或IgG-抗FcεRIα自身抗體使相鄰FcεRI直接交聯來激活效應細胞釋放炎癥介質[14-15]。但是，目前國內在臨床上尚未出現這類自身抗體的商品化診斷試劑盒，嚴重影響了抗FcεRIα自身抗體引起的此類疾病的診斷。因此，本研究通過基因工程技術制備了FcεRIα 蛋白并對其生物學功能進行了鑒定，不僅為抗FcεRIα自身抗體的診斷研究提供了實踐基礎，同時為后續進一步探討FcεRIα在IgE介導的過敏性疾病中的作用奠定了研究基礎。

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