PD-L1在乳腺癌中的表達及其與細胞免疫的相關性分析

王立東，徐衛國，楊 鑫，李蕊潔，諶娜娜，郭紅輝，趙躍鵬

(1.華北理工大學附屬醫院腫瘤外科，河北唐山063009；2.遷安市人民醫院腫瘤放化療科，河北遷安 064400；3.遷安市人民醫院病理科，河北遷安 064400；4.承德縣醫院外科，河北承德 067400)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。研究證實，乳腺癌的生物學行為具有高淋巴管侵襲性，轉移能力強，盡管經過規范的治療,但仍然有相當部分乳腺癌患者出現復發轉移。據統計，全球每年約52.2萬人死于乳腺癌[1]。因此研究乳腺癌中與復發、轉移相關，影響患者腫瘤微環境的異常信號通路，可能為乳腺癌的臨床治療提供新的靶點。本研究采用免疫組織化學法檢測乳腺腫瘤組織中程序性死亡受體1(PD-L1)蛋白的表達情況，流式細胞術檢測患者外周血清淋巴細胞亞群水平，探討PD-L1蛋白與乳腺癌臨床病理特征的相關性，并分析PD-L1蛋白表達水平與乳腺癌患者細胞免疫的相關性，旨在為乳腺癌的臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年9月至2016年9月于遷安市人民醫院行手術治療且臨床資料完整的114例乳腺癌患者病理標本，均為女性患者，年齡為33～78歲，中位年齡51歲，組織學類型均為浸潤性導管癌，術前均未行放療、化療或內分泌治療。乳腺癌病理標本根據第7版國際抗癌聯盟(UICC)乳腺癌TNM分期標準分期。根據術后免疫組織化學結果，雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)表達大于10%，即認為陽性；當人類表皮生長因子受體2(Her-2)為3+時認定為陽性，0～1+認定為陰性，2+時需結合FISH檢測結果，如存在基因拷貝數擴增認定為陽性，反之則為陰性；選擇Ki67陽性指數14%作為其表達水平高低的界定點，免疫組織化學結果顯示Ki67≥14%判定為Ki67高表達，<14%認定為Ki67低表達[2]；組織學分級：應用Bloom-Richardson分級法將乳腺癌組織標本分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級。本研究通過該院倫理委員會審批。患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1主要儀器和試劑 石蠟切片機購自德國Leica公司；倒置光學顯微鏡購自日本Nikon公司；病理標本微波處理儀購自意大利MILESTON公司，4 ℃冰箱購自美的冰箱廠，鼠抗人PD-L1單克隆抗體購自Proteintech公司；檸檬酸鈉-EDTA抗原修復液、5%牛血清清蛋白(BSA)封閉液、二抗、鏈霉素親和素-生物素-過氧化物酶(SABC)、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑、蘇木素購自MDL公司。

1.2.2免疫組織化學方法 乳腺癌組織石蠟塊連續切片，每片2.5 μm，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%雙氧水室溫下浸泡切片10 min，檸檬酸鈉-EDTA抗原修復液抗原修復，自然冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后使用5%BSA封閉液封閉組織，一抗(鼠抗人PD-L1單克隆抗體1∶100)孵育4 ℃過夜。PBS清洗后孵育二抗37 ℃，30 min。滴加SABC試劑孵育30 min，DAB顯色，蘇木素-伊紅(HE)復染，梯度乙醇脫水，樹膠封片觀察，隨機觀察5個高倍視野。

1.2.3染色結果評定 細胞質及細胞膜棕褐色為PD-L1陽性表現，染色結果按照每張切片陽性細胞比例及著色深淺計分，行半定量分析。根據每個視野陽性細胞率及著色強度進行分級計分，然后根據兩項之積平均數判定其陽性強度。染色強度評分：無色判定為0分，淡黃色判定為1分，棕黃色判定為2分，棕褐色判定為3分；再按陽性細胞百分率評分；陽性細胞小于5%為0分，5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積小于或等于1為陰性,大于1為陽性[3]。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析。非正態分布計量資料用M(P25，P75)表示，組間比較采用秩和檢驗。單因素分析采用Fisher確切概率法。計數資料用頻數表示，組間比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1免疫組織化學染色結果 實驗結果顯示，PD-L1陽性表達時，組織細胞膜和細胞質呈均勻染色狀態，為棕褐色，見圖1。在114例乳腺癌組織中，35例PD-L1蛋白陽性表達，陽性率為30.7%。

A:陰性表達 (HE×100)；B：陰性表達(HE×400)；C：陽性表達(HE×100)；D：陽性表達 (HE×400)。

圖1乳腺癌組織中PD-L1的表達

2.2PD-L1表達與臨床病理特征關系 PD-L1表達與腫瘤大小(T分期)、Ki-67表達水平、組織學分級相關(P<0.05)。與年齡、淋巴結狀態、ER、PR、Her-2表達水平無相關性(P>0.05)。PD-L1主要表達于腫瘤較大、分級高、Ki-67高表達的患者，見表1。

2.3PD-L1陽性表達與PD-L1陰性表達患者淋巴細胞亞群計數的比較 經兩獨立樣本的秩和檢驗，PD-L1陰性表達患者CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD16+CD56+細胞的水平高于PD-L1陽性表達患者(Z=10.705、9.135、7.563；P=0.009、0.016、0.024)，差異有統計學意義,見表2。

表1 PD-L1 的表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系(n)

表2 PD-L1陽性表達與PD-L1陰性表達患者淋巴細胞亞群計數的比較[M(P25，P75)]

3 討 論

PD-1是CD28/CTLA-4共刺激受體家族中的一員，與其配體PD-L1相互作用向T細胞傳遞一個抑制信號從而在腫瘤部位產生免疫抑制的腫瘤微環境[4]。腫瘤細胞可異常上調 PD-1及PD-L1的表達，抑制 T 細胞的免疫活性，造成腫瘤免疫逃逸，導致腫瘤發生、發展[5]。PD-L1不僅表達于抗原提呈細胞(APC)和樹突狀細胞，也表達于活化的單核細胞和B細胞，不同器官的非淋巴組織[6]。研究表明，PD-L1 亦表達于人類多種腫瘤細胞表面，例如肺癌、腎癌、黑色素瘤、乳腺癌等，抑制T細胞的活化，誘導其凋亡，促進腫瘤進展[7]。

本研究納入114例乳腺浸潤性導管癌患者，免疫組織化學法檢測乳腺癌組織中PD-L1蛋白表達情況，結果顯示PD-L1表達于乳腺癌組織的細胞膜和細胞質中，染色均勻，著色明顯，共35例PD-L1陽性表達，陽性率為30.7%。區燕華等[8]用免疫組織化學方法檢測了154 例乳腺癌組織中PD-L1 的表達情況，結果顯示其陽性表達率為22.7%，與本課題研究結果相近。耿衛樸[9]研究了40例乳腺浸潤性導管癌中PD-L1的表達情況，發現PD-L1陽性表達率為45%，與本課題研究結果有一定差別。本研究采用Fisher確切概率法分析PD-L1與臨床病理特征的相關性，結果顯示PD-L1表達與腫瘤大小、組織學分級、Ki-67的表達情況相關(P<0.05)，與ER、PR、Her-2、淋巴結狀態無明顯關聯性。PD-L1主要表達于腫瘤大于5 cm、Ki-67高表達及高組織學分級患者中，與QIN等[10]報道的結果相似，提示PD-L1的表達與更差的病理學特征相關。本研究采用獨立樣本秩和檢驗對PD-L1陽性表達組與PD-L1陰性表達組患者淋巴細胞亞群計數進行了比較，結果顯示PD-L1陰性表達組患者CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD16+CD56+細胞的水平高于PD-L1陽性表達組患者，兩組CD3+CD8+、CD3-CD19+、CD4+/CD8+的細胞表達水平差異無統計學意義，而以上標記細胞亞群所代表的功能分別為：CD3+與人體T細胞免疫相關，其降低提示著機體免疫功能低下；CD3+CD4+和CD3+CD8+代表著輔助/誘導型T細胞和抑制/細胞毒性T細胞，其升高與降低與總T細胞相似；CD3-CD19+細胞水平的高低可反映機體細胞免疫的狀態；CD3-CD16+CD56+細胞的水平則反映機體內NK細胞的活性，其可見于某些腫瘤細胞及病毒感染的細胞毒性作用；CD4+/CD8+比值的異常提示患者機體免疫功能處于失衡狀態。本研究的結果提示，PD-L1的高表達可以惡化乳腺癌患者自身的細胞免疫，其機制可能與PD-L1相關通路抑制患者機體細胞免疫相關。

腫瘤的免疫治療已然成為一種治療腫瘤的重要方式。得益于癌細胞對常規治療較敏感，使得部分乳腺癌患者的生存時間較其他惡性腫瘤患者更長，但復發轉移性乳腺癌目前尚不可治愈，現有治療手段終將會對這部分患者失效。這些腫瘤患者有可能在現有治療方法全部失敗后再次獲益于抗PD-1/PD-Ls治療，使其生存期進一步延長。本研究采用免疫組織化學法，以乳腺癌組織中PD-L1蛋白的表達情況為切入點，探討PD-L1蛋白與乳腺癌臨床病理特征的相關性，并分析PD-L1 蛋白表達水平與乳腺癌患者細胞免疫的相關性，結果顯示PD-L1的表達與乳腺癌更差的臨床病理特征密切相關，PD-L1的表達可以提示患者細胞免疫功能的下降。

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[10]QIN T,ZENG Y,QIN G,et al.High PD-L1 expression was associated with poor prognosis in 870 Chinese patients with breast cancer[J].Oncotarget,2015,6(32):33972-33981.