62例熱性驚厥患者的SCN3A基因突變篩查分析*

陳勇軍，劉稀金，何 娜，石奕武，曹 琳，李 欣，何妍妍，易毅利

(1.南華大學附屬南華醫院神經內科，湖南衡陽 421002；2.廣州醫科大學附屬第二醫院神經科學研究所，廣州 510120)

熱性驚厥(febrile seizures，FS)是與發熱及年齡相關的兒童時期最常見的神經系統疾病之一，體溫38.5℃以上容易發作，發病年齡一般在3個月到6歲，患病率為3%～5%。發作形式多樣化，但最多見為強直陣攣發作。電壓門控鈉離子通道基因突變是FS的最常見病因，家族性患者中更為多見[1]。SCN1A基因是與FS關系最為密切的基因[2-3]，迄今發現突變最多，其次是SCN2A基因突變[4]。SCN1A、SCN2A和SCN3A為鈉通道的不同亞型，基因定位相似[5]，功能特性上可能具有相似性，SCN3A基因突變是否與FS相關，值得深入的研究。因此本研究就62例FS患者的SCN3A基因突變篩查分析報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 病例來源于2012年1月至2016年2月在南華大學附屬南華醫院神經內科及小兒科，以及廣州醫科大學附屬第二醫院癲癇中心就診的FS患者。納入標準：(1) 起病年齡在3個月至6歲，由于急性發熱而誘發的全面性強直陣攣發作，但排除顱內感染或腦損傷等疾病；(2)FS持續到6歲以后，或出現無熱驚厥，發作形式表現為部分性和或全面性發作；(3) 性別及就診年齡不限。選取100 名健康志愿者作為對照。本研究經所在醫院倫理委員會批準，入組對象簽署知情同意書。參照文獻將入組患者分為4類[6-7]，依次為：FS、部分性癲癇伴熱性驚厥附加征(partial epilepsy with febrile seizures plus,PEFS+)、全面性癲癇伴熱性驚厥附加征(generalized epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+)、嬰兒重癥肌陣攣性癲癇(severe myoclonic epilepsy in infancy,SMEI)。共入組患者62例，男38例，女24例，首發年齡(2.3±0.5)歲。分類診斷為單純的熱性驚厥8例，熱性驚厥附加征(FS+)11例，PEFS+13例，GEFS+17例，SME 13例。62例中有FS家族史15例，另47例為散發；28例智能發育差，34例智能正常。發作形式表現出多樣化，其中復雜部分性發作(complex partial seizure，CPS)27例，全面性強直陣攣發作(generalized tonic-clonic seizure，GTCS) 15例，繼發性GTCS(secondary GTCS，sGTCS)17例，失神9例，肌陣攣18例，強直16例，陣攣24例，10例表現出癲癇持續狀態，其他發作形式8例。腦電圖有局灶性棘慢波發放的22例，全面性棘慢復合波16例，未見明顯放電的17例，其他7例。影像學提示有異常的13例，如大腦皮質發育不良、皮質局灶性低密度影、海馬萎縮等。藥物以丙戊酸鈉口服液使用最多，其次奧卡西平、卡馬西平、拉莫三嗪、托吡酯、氯硝西泮等，單藥治療控制較好的23例，其余使用二聯或三種以上藥物。

1.2方法

1.2.1DNA提取 采集了熱性驚厥患者及健康志愿者的外周靜脈血4 mL，采用美國基因技術有限公司提供的Quick-Gene-610L及QuickGenen mini80基因組DNA快速提取試劑盒抽提DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.2引物合成 參照LIAO等[7]的研究合成引物，序列覆蓋外顯子編碼區和內含子-外顯子剪切區，由上海生工生物有限公司合成，GenBank號為SCN3A(NM066922)。

A:c.905A>G/p.N302S；B：c.5179G>A/p.D1727N；C：c.1441C>T/p.L481L；紅色箭頭：突變位點；黑色箭頭：正常對照

圖1 SCN3A基因突變位點測序圖

1.2.3基因篩查策略 PCR方法擴增SCN3A 基因全部外顯子，使用東盛生物科技有限公司的Taq DNA酶和2×HSTM Reaction Mix冰上配置 PCR體系(基因組200 ng+正反向引物各5 μL+Mix 25μL+Taq酶0.5 μL+ddH2O至50 μL，引物工作濃度為10 μmol/L)，摸索合適的條件擴增外顯子片段，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，若產物特異性好，則連同引物送至北京六合華大基因有限公司測序。采用Vector-NTI-V8.0生物軟件進行序列比對，并對發現的突變位點做與健康人的對照。

1.2.4生物軟件分析 對于發現的突變位點，采用Clustalx1行保守性分析及Mutation Taster軟件預測其致病性。

2 結 果

2.1發現的突變位點 檢測了62例患者，共發現2例雜合錯義突變(c.905A>G/p.N302S，c.5179G>A/p.D1727N)和1例多態性位點(c.1441C>T/p.L481L)，見圖1。c.905A>G導致了氨基酸302位的遺傳密碼子由AAT變成AGT，使得天冬酰氨被絲氨酸取代，該突變位于第6號外顯子上，父母親DNA驗證提示來源于母親。c.5179G>A導致遺傳密碼子由GAC變成AAC，1727位天冬氨酸被天冬酰氨取代，位于第26號外顯子上，父母親中沒有發現相同位點改變，提示為新生突變。另外在10例患者和18名健康者中存在c.1441C>T變異，考慮為多態性位點，遺傳密碼子由CTG變成TTG，但編碼的亮氨酸不變，為同義突變(L481L)。

2.2突變位點致病性分析 兩個錯義突變都位于在鈉離子通道的孔區，前者在DⅠ S5～S6，后者在DⅣ S5～S6，見圖2。在人的分布于神經系統鈉通道亞型中(如SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN8A、SCN9A 、SCN10A)及哺乳動物大鼠小鼠中序列一致，見圖2。在100名健康者中沒有發現同樣的變異， Mutation Taster 軟件分析在ExAC 和千人基因組計劃中沒有發現相應的突變位點。

A:突變位點在鈉離子通道上的位置示意圖；B：突變位點的保守性分析

圖2突變位點位置示意圖及保守性分析

2.3典型病例 2例突變患者為1男1女，首發年齡分別為6.0歲和3.5歲，都以FS起病，發熱大于38.5 ℃，1例有家族史，其姑媽2～5歲時有FS，此后未有再發。發作形式上1例表現為全面性發作，另1例為部分性發作為主，間斷繼發全面性發作。2例都有智能障礙，尤其是語言功能有明顯受損。腦電圖分別提示為全面性慢波及局灶性慢波發放， MRI提示1例正常，1例左側海馬信號略高。治療上都是聯合兩種以上藥物，癥狀才得以緩解，診斷分別為GEFS+和PEFS+，結果見表1。

表1 2例錯義突變患者的臨床特征

VPA：丙戊酸鈉； LTG：拉莫三嗪； OXC：奧卡西平；LEV：左乙拉西坦

3 討 論

FS是兒童中最常見的發作類型，復發性熱性驚厥是成年后顳葉癲癇的危險因素之一。FS的發病機制是多因素的，大家系連鎖分析揭示了FS是常染色體顯性遺傳模式，目前已經有11個染色體位點上存在有FS基因定位[8]，命名為FEB1～FEB11，其中位點 FEB3(2q23～24)與 SCN1A、SCN2A 和 SCN3A 基因在2號染色體上的簇集位置一致，功能特性上具有相似性，與癲癇發作有關[9]。SCN1A和SCN2A基因突變都已經明確與FS相關。SCN3A基因與SCN1A及SCN2A的位置相近，分布于中樞神經系統，亞細胞定位于神經元的胞體和樹突，但是SCN3A突變是否與熱性驚厥相關，沒有專門的研究報道。2014年VANOYE等[10]在局灶性癲癇患兒中報道了4個新的SCN3A突變，其中1例存在M1323V突變的患兒，16個月大時僅表現為單純性熱性驚厥發作。該突變可能是SCN3A基因中第一個被報道與FS相關的突變位點。

本研究在62例FS患者中進行SCN3A篩查，僅發現2例錯義突變以及1例多態性位點，突變率僅為3.23%(2/62)，在100名健康對照中未發現相同位點改變，生物信息學分析表明2個突變點保守性高，在ExAC和千人基因組計劃中沒有發現相應的突變位點，有可能是致病性突變。有研究利用陣列CGH技術，發現在1例癲癇患兒中的2號染色體上存在12 Mb長度的鈉通道集群的缺失，該缺失片段覆蓋了SCN3A基因，該患者同時存在FS發作及智能障礙[11]。本文中發現的2例突變患者都存在中度或重度智能障礙，在伴有智能障礙的FS患者中的SCN3A的突變率為7.14%(2/28)，而在34例智能正常的患者中無突變發現，因此伴有智能障礙者中的突變率高于總突變率，可能是因為SCN3A突變與智能障礙相關，最近的文獻報道進一步支持SCN3A與兒童智能相關[12]。當然這一現象的進一步確認，需要后續更大樣本去做驗證。

FS具有非常明確的遺傳易感性，已報道與多種基因突變相關，而且患者同胞的患病率較普通人群至少高20%[13]，所以在家族性中發病應該更為常見。對于發現的基因突變如何導致癲癇的發生，仍然是非常復雜的問題，鈉離子通道基因發生突變后導致了通道的功能發生了改變，進一步的功能研究有助于闡明基因突變導致癲癇發作的分子機制[14]，構建體外細胞模型進行膜片鉗電生理功能研究是一種重要的探索[15]。

[1]GUPTA A.Febrile Seizures[J].Continuum(Minneap Minn),2016,22(1):51-59.

[2]NAKAYAMA J,ARINAMI T.Molecular genetics of febrile seizures[J].Epilepsy Res,2006,70 Suppl 1:S190-198.

[3]NAKAYAMA J.Progress in searching for the febrile seizure susceptibility genes[J].Brain Dev,2009,31(5):359-365.

[4]SHI X,YASUMOTO S,KURAHASHI H,et al.Clinical spectrum of SCN2A mutations[J].Brain Dev,2012,34(7):541-545.

[5]WEISS A,ESCAYG A,KEARNEY A,et al.Sodium channels SCN1A,SCN2A and SCN3A in familial autism[J].Mol Psychiatry,2003,8(2):186-194.

[6]BAULAC S,GOURFINKEL-AN I,NABBOUT R,et al.Fever,genes,and epilepsy[J].Lancet Neurol,2004,3(7):421-430.

[7]LIAO W P,SHI Y W,LONG Y S,et al.Partial epilepsy with antecedent febrile seizures and seizure aggravation by antiepileptic drugs:associated with loss of function of Na(v) 1.1[J].Epilepsia,2010,51(9):1669-1678.

[8]SAGHAZADEH A,MASTRANGELO M,REZAEI N.Genetic background of febrile seizures[J].Rev Neurosci,2014,25(1):129-161.

[9]YOSHITOMI S,TAKAHASHI Y,ISHIZUKA M,et al.Three patients manifesting early infantile epileptic spasms associated with 2q24.3 microduplications[J].Brain Dev,2015,37(9):874-879.

[10]VANOYE C G,GURNETT C A,HOLLAND K D,et al.Novel SCN3A variants associated with focal epilepsy in children[J].Neurobiol Dis,2014,62(62):313-322.

[11]VECCHI M,CASSINA M,CASARIN A,et al.Infantile epilepsy associated with Mosaic 2q24 duplication including SCN2A and SCN3A[J].Seizure,2011,20(10):813-816.

[12]THURESSON A C,VAN BUGGENHOUT G,SHETH F,et al.Whole gene duplication of SCN2A and SCN3A is associated with neonatal seizures and a normal intellectual development[J].Clin Genet,2017,91(1):106-110.

[13]IWASAKI N,NAKAYAMA T,HAMANO T,et al.Molecular genetics of febrile seizures[J].Epilepsia,2002,43(9):32-35.

[14]LAMAR T,VANOYE C G,CALHOUN J,et al.SCN3A deficiency associated with increased seizure susceptibility[J].Neurobiol Dis,2017,102(11):38-48.

[15]CHEN Y J,SHI Y W,XU H Q,et al.Electrophysiological differences between the same pore region mutation in SCN1A and SCN3A[J].Mol Neurobiol,2015,51(3):1263-1270.