花生根中白藜蘆醇的提取與含量測定

葉夢娜，馮杉，劉曉敏，張娟，肖炯昌，馬琳*

1. 天津中醫藥大學（天津 301617）；2. 北京中醫藥大學東方學院（廊坊 065001）

白藜蘆醇（又名芪三酚），化學名為3, 5, 4-三羥基二苯乙烯（3, 5, 4-trihydrolystilbene），是含有芪類結構的非黃酮多酚類化合物，其具有抗菌、抗氧化、抗自由基、抗癌、預防心臟病、抗血小板凝集、保護肝臟、防輻射、降血脂、抗誘變、抗艾滋病等生理活性[1-3]。大量研究表明花生資源，尤其是根的開發利用將是白藜蘆醇的重要植物資源。我國花生資源極其豐富，是世界花生產量最高（占世界總產量的1/3）且出口最多的國家。常年種植面積466.7萬 hm2左右，總產量約占全球2/5[4]，花生的根和莖作為花生收獲后的廢棄物，在農村基本用作動物的飼料或燃料。但其中白藜蘆醇含量相當高，特別是花生根，其白藜蘆醇含量是花生仁的數十甚至數百倍，更是葡萄酒中含量的數百倍[5]。研究了花生根中白藜蘆醇提取工藝，以期為花生根的合理開發利用和天然白藜蘆醇原料的工業化提取提供參考與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 材料

試驗材料為“阜花”系列品種花生的根，2015 年7月收集于遼寧省新民市，清水洗凈，低溫烘干，粉碎，過40目篩后備用。

1.1.2 儀器與設備

FW80高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；標準篩（浙江上虞市道墟五四儀器廠）；JD200-3G型電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）；JD60-4型電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）；電子調溫電熱套（北京科華實驗儀器有限公司）；Agilent1100高效液相色譜儀，VWD檢測器（G1314A），四元泵（G1311A）（美國Agilent公司）。

1.1.3 試劑

對照品白藜蘆醇（2015年購自天津士蘭科技有限公司），對照品純度≥98%。乙醇為分析純，乙腈為色譜純，水為重蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 花生根中白藜蘆醇的提取

準確稱取一定量粉碎后的花生根試驗材料，放入圓底燒瓶中，料液比1∶15（g/mL），加入70%乙醇溶液，回流提取3次，每次1 h，過濾，3份濾液分別保存。

1.2.2 花生根中白藜蘆醇的測定

分別從3份濾液中各取1 mL，離心后HPLC測定提取液中白藜蘆醇含量。離心條件為：10 000 r/min，10 min，15 ℃。HPLC色譜條件為：色譜柱為Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-水（B）。洗脫條件為：乙腈-水（30∶70，V/V），檢測波長305 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL。

1.2.3 標準曲線的繪制

吸取一定量的白藜蘆醇對照品原溶液，配制成425，850，1 700，3 060，6 290和13 000 ng/mL的對照品溶液，分別精密吸取各濃度對照品溶液20 μL，依次注入高效液相色譜儀，平行進樣3次，以各成分的峰面積平均值為橫坐標（X），其對照品溶液濃度（ng/mL）為縱坐標（Y），繪制標準曲線，如圖1所示。結果表明，白藜蘆醇在8.5～260 ng范圍內線性關系良好，其回歸方程為Y=0.003X+94.89（r=0.999 6）；以HPLC法來確定花生根中白藜蘆醇的提取量。

圖1 白藜蘆醇對照品標準曲線

2 結果與分析

2.1 花生根中白藜蘆醇提取工藝參數的優化

采用常規的正交試驗研究花生根中白藜蘆醇的提取工藝條件，正交試驗設計見表1，正交試驗結果見表2。

表1 正交試驗設計方案L9(33)

表2 正交試驗結果

由試驗結果分析得知，乙醇體積分數是最主要因素，其次是提取時間，最后是料液比。3個因素的水平組合A2B2C3為此次試驗的最優水平組合，即花生根中乙醇提取白藜蘆醇的最優工藝條件為70%乙醇，料液比1∶15（g/mL），提取時間1 h。

2.2 花生根白藜蘆醇提取次數的考察

按1.2.1提取方法，準確稱取10 g粉碎后的花生根，放入圓底燒瓶中，按料液比1∶15（g/mL）加入70%乙醇溶液，回流提取5次，每次1 h，過濾，濾液分別保存。按1.2.2測定方法對花生根中白藜蘆醇含量進行測定。進行3次平行試驗，白藜蘆醇含量測定結果見表3。

表3 不同提取次數下白藜蘆醇含量測定結果μg/g

2.3 花生根中白藜蘆醇的含量

花生根中白藜蘆醇的提取及測定分別按試驗方法1.2.1和1.2.2操作，準確稱取200 g粉碎后的花生根試驗材料，放入圓底燒瓶中，按料液比（1∶15）加入3 000 mL 70%乙醇溶液，回流提取3次，每次1 h。平行試驗10次，結果見表4。

表4 試驗材料花生根中白藜蘆醇含量測定結果 μg/g

3 討論與分析

3.1 花生根白藜蘆醇提取次數及吸收波長的確定

由表3可知，隨著提取次數的增加，白藜蘆醇提取率雖有所增加，但提取率增加不明顯。由3次平行試驗結果可知，提取次數為4次時，與提取次數為3次相比，平均增加1.1%；提取次數為5次時，與提取次數為3次相比，平均增加0.2%；由試驗結果可知，花生根白藜蘆醇提取次數為3次時最佳。HPLC法測定白藜蘆醇含量，流動相為乙腈-水（30∶70，V/V）時，檢測波長在305 nm處吸收峰面積大且峰形較好；另外，取白藜蘆醇甲醇標準液，以甲醇為參比，用紫外分光光度計在200～900 nm波長間掃描，該標準品在305 nm處有最大吸收峰，故白藜蘆醇檢測波長確定為305 nm。

3.2 花生根白藜蘆醇含量說明

為了驗證提取方法的可行性和穩定性，采用得到的最佳提取方法，平行進行10次試驗，由表4可知，10次試驗，花生根中白藜蘆醇的含量在0.044 7～0.050 1 mg/g之間，平均含量為0.047 3 mg/g。表明提取方法具有較好的穩定性。相關研究表明花生種子中白藜蘆醇含量為0.02～1.79 μg/g[6]，花生根中白藜蘆醇含量最高可達1.33 mg/g[5]。試驗所得結果，白藜蘆醇含量偏低，分析原因可能為以下兩點：①研究表明[7-9]，花生的根、莖、花、果殼、種衣5個部位中含有白藜蘆醇，其中花生根中含量最高，花生葉、花生胚乳中沒有檢測到白藜蘆醇。研究的試驗材料除根外，還包含有一定量的花生莖，這可能導致所提取的白藜蘆醇含量偏低；②有研究表明在對花生根提取白藜蘆醇前，用纖維素酶對花生根進行酶解預處理，酶解后的花生根與沒有酶解的花生根相比，白藜蘆醇的提取條件有明顯差別，酶解后的花生根提取時間短，提取所需溫度低，乙醇用量少，其原因為纖維素酶能酶解花生根的細胞壁，使白藜蘆醇能更容易溶出，同時能使白藜蘆醇苷酶解成白藜蘆醇。研究在提取白藜蘆醇前，沒有使用纖維素酶對花生根進行酶解預處理，這也可能導致提取的白藜蘆醇含量偏低。

3.3 討論

研究在驗證花生根中白藜蘆醇提取方法的可行性和穩定性的過程中，有目的地稱取較大量的花生根試驗材料（200 g），平行進行10次試驗，是想更好地模擬從花生根中大量提取白藜蘆醇的可行性，結果表明提取方法具有較好的可行性和穩定性。我國每年花生收獲后都會剩余大量的花生根，作為花生收獲后的廢棄物，在農村基本用作動物的飼料或燃料。

4 結論

我國每年花生收獲后都會剩余大量的花生根，作為花生收獲后的廢棄物，在農村基本用作動物的飼料或燃料。研究表明花生根中白藜蘆醇含量較高，是一個值得重視的天然白藜蘆醇來源。對花生根中白藜蘆醇的提取工藝條件進行了正交試驗、提取次數考察，確定了花生根中乙醇提取白藜蘆醇的最優工藝條件：70%乙醇，料液比1∶15（g/mL），提取時間1 h，并驗證了提取方法的可行性和穩定性。此次研究中白藜蘆醇的提取及測定方法，可為花生資源的進一步開發利用和花生根中白藜蘆醇的工業化提取提供參考依據。