曲古霉素A對脊髓損傷小鼠的神經保護作用

劉雯雯，程　田，馬珊珊，黃團結，劉艷霞，程　康，李　鵬，許　玲，楊　璐，張　濤，關方霞

1)鄭州大學生命科學學院干細胞研究室 鄭州 450001　2)鄭州大學第一附屬醫院骨科 鄭州 450052

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴重的中樞神經系統損傷，目前尚未發現有效的治療手段。表觀遺傳調控是一種以染色質為基礎的基因表達調控，其中組蛋白乙酰化是表觀遺傳調控中較為廣泛的一類研究。研究[1]發現組蛋白的乙酰化水平與多種神經疾病相關。有報道[2]表明組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制劑能調節神經干細胞的分化。TSA是一種穩定且高效的HDAC抑制劑。有研究[3]證實TSA能夠對小鼠缺血性腦損傷等腦損傷疾病發揮神經保護作用，但是關于TSA在SCI后是否具有神經保護功能的研究尚未見報道。所以本研究以此為背景，探究TSA對SCI小鼠的神經保護作用。

1　材料與方法

1.1材料TSA購于美國Sigma公司，ELISA試劑盒購于美國 Tsz Biosciences 公司，碘化丙啶購自美國Sigma公司，二氫乙錠(HEt)購于美國Medchemexpress公司，TUNEL試劑盒購于南京建成生物工程研究所，兔抗髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)單克隆抗體購于英國Abcam公司，兔抗NeuN單克隆抗體購于美國CST公司，熒光二抗CY3購于上海生工生物有限公司，RNA提取試劑盒、反轉錄及實時定量PCR試劑盒均購于日本TaKaRa公司。實驗所用雄性C57BL/6小鼠，8～12周齡，體重20～26 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。實驗動物方案由鄭州大學動物護理與使用委員會批準。

1.2SCI動物模型的建立腹腔注射100 g/L的水合氯醛(0.33 mL/kg)麻醉小鼠。將已麻醉的小鼠放置在實驗臺上，沿著背部中線剪開皮膚，去除T9/10水平椎板，暴露硬脊膜。將小鼠固定在立體定位儀上，采用改良小鼠Allen′s法擊打T10節段制備小鼠SCI模型[4]。致傷瞬間，小鼠痙攣性擺尾、雙下肢及軀體回縮撲動后雙下肢癱瘓為造模成功的標志。分別縫合肌肉和皮膚切口。術后對實驗小鼠進行膀胱按摩，3次/d，以助其排尿直到膀胱恢復功能。

1.3實驗分組36只小鼠造模后隨機分為對照組(Vehicle組,Veh組)和TSA治療組(TSA組)，每組18只。兩組小鼠均在術后3 h通過尾靜脈注射給藥，TSA組給予1 mg/kg TSA(2 g/L)，Veh組注射等量的生理鹽水，1次/d，連續注射3 d。

1.4小鼠后肢功能評估兩組各取8只小鼠，在SCI后第1、3、7、14、21和28天，使用詳細的Basso Mouse Scale (BMS評分)標準，在曠場中對小鼠后肢功能進行評估[5]。評分0～9分，0表示后肢完全麻痹，9表示后肢完全正常。由2名觀察者分別進行評分，取均值。

1.5PI染色和ROS染色SCI后第3天，2組各取5只小鼠，于處死前1 h腹腔注射10 g/L的碘化丙啶(0.4 mg/kg)，麻醉后心臟取血備用，處死后取損傷部位脊髓組織，冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察壞死細胞數并拍照。2組另取5只小鼠，腹腔注射1 g/L的Het，1 h后麻醉，心臟取血備用，處死小鼠，常規處理后，脊髓組織切片，熒光顯微鏡拍照觀察，記錄活性氧(ROS)的積累。

1.6小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-10表達的檢測將1.5中小鼠心臟所取血液標本(n=6)靜置分層，離心吸取上清，按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，檢測小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-10的表達。

1.7神經營養因子的檢測取1.4中SCI第28天的小鼠3只，麻醉后處死，取損傷節段脊髓組織，用RNA提取試劑盒提取組織RNA，使用反轉錄和實時定量PCR試劑盒，參考說明書的步驟，以GAPDH作為內參，檢測腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和神經營養因子3(neurotrophin-3，NT3)mRNA的表達，按2-ΔΔCt法計算定量。引物序列和片段長度見表1。實驗重復3次。

表1　小鼠BDNF、NT3引物序列

1.8免疫熒光染色取1.4中SCI后第28天組的剩余5只小鼠，麻醉處死，取損傷部位脊髓組織制作冰凍切片。參照文獻[6]方法對切片進行免疫熒光染色，檢測MBP(11 000，標記脊髓白質中的正常髓鞘)和神經元標記基因NeuN(1200)。熒光顯微鏡下觀察拍照，分別記錄MBP染色陽性區域面積占總面積的百分比和進行神經元計數。

1.9統計學處理應用SPSS 21.0進行分析。兩組SCI后不同時間點BMS評分的比較采用重復測量數據的方差分析，兩組間同一時間點其他指標的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1兩組小鼠運動功能的比較兩組小鼠術后不同時間點運動功能BMS評分的比較見表2。BMS評分結果顯示，從第7天開始TSA治療組BMS評分高于Veh組。

表2　兩組小鼠術后BMS評分比較

F組間=40.320，F天數=97.120，F交互=5.350，P<0.01；*：與Veh組相比，P<0.05

2.2兩組小鼠損傷部位細胞壞死情況和ROS水平的比較結果見圖1，表3。可知TSA能減輕SCI部位的細胞壞死情況，降低損傷部位ROS的表達，減輕氧化損傷。

1：細胞壞死情況(PI染色)；2：ROS的產生情況(HEt染色)；3、4：分別為脊髓組織MBP的含量及NeuN的表達(免疫熒光染色)圖1　兩組小鼠損傷部位不同指標的比較

表3　兩組小鼠損傷部位壞死細胞數和ROS水平的比較

2.3兩組小鼠血清中炎癥因子水平的比較結果見表4。TSA組小鼠血清中IL-10的含量較Veh組升高，而TNF-α的含量降低。

表4　兩組小鼠損傷后血清中IL-10和TNF-α的表達水平

2.4兩組小鼠損傷部位神經營養因子的表達比較

結果見表5。由表5可知，TSA組的BDNF和NT3 mRNA的表達量高于Veh組。

2.5兩組小鼠損傷部位MBP染色陽性區域面積占總面積百分比及神經元計數比較結果見圖1，表5。由表5可知，TSA組MBP染色陽性區域(白質)面積占總面積百分比高于Veh組，且神經元表達數量明顯增多。

表5　兩組小鼠神經營養因子的表達及MBP染色和神經元計數結果

3　討論

TSA是鏈霉菌代謝產物，最初被當作抗真菌藥物使用，之后被發現可誘導細胞分化[7]。目前，在表觀遺傳學中，TSA作為一種穩定而高特異性的HDAC抑制劑而備受關注。研究[8]發現HDAC抑制劑具有廣泛的神經保護作用，并且神經保護功能與其對HDAC的抑制有關[9]。許多神經系統疾病與蛋白質乙酰化水平和相關轉錄功能障礙的不平衡有關[10]。HDAC抑制劑能夠增加組蛋白乙酰化，調節基因轉錄和上調神經營養因子的表達，因此有望用于干預治療中樞神經系統疾病[11-12]。有研究[13]證實HDAC抑制劑丙戊酸能夠在SCI后改善小鼠的運動情況和促進神經元的軸突生長，因此，本實驗以此為背景進行了相關研究。

SCI按照病理生理過程分為原發性損傷和繼發性損傷，原發性損傷是不可逆損傷，繼發性損傷主要包括氧化應激和炎癥反應、興奮性毒性、鈣超載、微循環障礙及電解質失衡等，SCI的治療主要是減輕繼發性損傷造成的傷害[14]。有文獻[15]報道，TSA在體外能減輕氧化損傷產生的ROS，減輕氧化損傷。同時，作為HDAC抑制劑，TSA可能上調神經營養因子，降低炎癥反應，改善損傷區域的微環境，減輕損傷區域的細胞壞死和白質損傷。研究[16]還證實TSA具有促進干細胞分化的能力，所以可能會促進損傷區域神經元的表達。

本研究采用TSA治療SCI證實了以上推斷。BMS評分作為小鼠SCI后評價后肢運動功能的標準，TSA組的BMS評分高于Veh組，表明TSA有利于小鼠后肢運動功能的恢復。通過TSA治療，小鼠損傷部位ROS含量減少，同時，ELISA結果表明血清中抑炎因子IL-10含量升高而炎癥因子TNF-α含量減少。qRT-PCR結果顯示TSA組神經營養因子BDNF和NT3 mRNA的表達量均高于Veh組，損傷部位壞死細胞數量和白質損傷情況也有明顯改善，并且神經元的數量亦較Veh組增多。由此可得出TSA對SCI小鼠有神經保護作用。

我們推測TSA對神經保護的具體機制可能是由于其能激活Nrf2/ARE通路。Nrf2/ARE通路是經典的氧化應激通路，能減輕損傷后由于氧化應激造成的繼發性損傷。但是在SCI小鼠模型中，TSA是否是由于激活Nrf2/ARE通路而發揮神經保護的作用還不清楚，仍需在以后的研究中進一步探討。

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