萊菔硫烷對發育早期鉛暴露小鼠學習記憶能力及海馬組織β淀粉樣蛋白表達的影響

孫貝貝，張曉歡，葛惠娜，王　俊，韓　涵，王　騰，李文杰

鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 450001

鉛是一種廣泛存在于環境中的重金屬污染物，人們可以通過食用被鉛污染的食物、飲用被腐蝕管道中含鉛的水等多種途徑接觸鉛，進而引發鉛中毒。低水平的鉛暴露對嬰幼兒及兒童的生長發育可產生影響，改變認知和行為表現，增加齲齒的風險。在阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)發生發展中氧化應激也起著關鍵性的作用[1]，越來越多的研究[2]證明，發育早期鉛暴露與AD存在關聯。AD是一種起病隱匿，以記憶和認知功能下降為主要特點的中樞神經系統退行性疾病。細胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)沉積形成的老年斑和細胞內Tau蛋白過度磷酸化形成的神經纖維纏結是AD的主要病理特征。萊菔硫烷(sulforaphane, SFN)是一種天然無不良反應的植物化學物，主要存在于西藍花、芥藍等十字花科植物中，具有抗腫瘤、抗氧化、抗凋亡、抗炎等多種生物功能。研究表明，SFN具有神經保護作用，能夠改善特發性帕金森[3]、糖尿病[4]等疾病引起的認知和記憶障礙，但對于發育早期鉛暴露小鼠的干預作用未見報道。本研究以SFN對鉛暴露小鼠的子代進行干預，觀察子代小鼠神經行為學的改變，檢測小鼠血液中鉛的含量及海馬組織中Aβ的水平，探討SFN對發育早期通過母乳鉛暴露仔鼠的干預作用。

1　材料與方法

1.1試劑及儀器醋酸鉛(洛陽市化學試劑廠)，SFN(加拿大TRC公司)，氯化鈉(天津市科密歐化學試劑有限公司)，水合氯醛(洛陽市化學試劑廠)，Aβ1-40、Aβ1-42酶聯免疫吸附測定試劑盒(美國R&D Systems公司)，Milli-Q Synthesis超純水儀(美國Millipore公司)，Morris水迷宮(北京碩林苑科技有限公司)，797伏安極譜儀(瑞士萬通公司)，微量移液器(德國Eppendorf公司)，HVE-50高壓滅菌用蒸汽鍋(日本Hirayama公司)，臺式高速低溫離心機(德國Heraeus公司)，電熱恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)，680ELX-800型酶聯免疫檢測儀(美國伯樂公司)。

1.2動物分組及處理所有的動物實驗程序嚴格遵循動物保護國際標準和指導方針并根據鄭州大學倫理委員會的規定護理和使用實驗動物。SPF級昆明小鼠12只(8只雌性，4只雄性，8周齡)，購于河南省實驗動物中心，動物合格證號SYXK 2012-0007。小鼠在屏障環境中飼養，嚴格控制環境條件，晝夜周期為12 h(7：00開燈)，溫度18～22 ℃，濕度50%～60%，環境嚴格控制以免造成鉛污染。實驗小鼠自由飲水和進食，適應性喂養1周后，雌鼠按體重采用隨機數字表法分為2組：染毒組(4只)和正常組(4只)，染毒組小鼠飲用2 g/L的醋酸鉛[5]溶液21 d，正常組飲用無鉛去離子水。染毒結束后，每日20:00點按雌雄=21合籠，次日8:00檢查陰栓，陰栓不確定者做陰道涂片，確定受孕日期，孕鼠單籠飼養。仔鼠斷乳(出生后21 d)后，染毒組小鼠按體重隨機分為鉛暴露組和SFN干預組，每組10只，分籠飼養，正常組仔鼠中選取10只作為對照組。SFN干預組小鼠斷乳后經口單次灌胃SFN，劑量為25 mg/kg[6]；鉛暴露組灌胃生理鹽水；對照組自由飲用無鉛去離子水，持續4周。灌胃結束后，小鼠進行神經行為學測試。

1.3小鼠學習記憶能力測定灌胃結束后，采用Morris水迷宮對小鼠進行空間學習記憶能力的檢測。水迷宮測試參考文獻[7]。前5 d為定位航行實驗，每次選擇東、南、西、北4個象限的任意象限作為起始，受試小鼠面對池壁放入水中開始計時，找到平臺并停留2 s終止計時，此時間為逃避潛伏期。如果小鼠在60 s內未找到平臺，則實驗者將其引至平臺并適應10 s，此時逃避潛伏期記為60 s。每只仔鼠每天訓練4次，連續5 d，每次間隔至少1 h。第6天進行空間探索實驗，將池中平臺撤出，任選一個入水點將小鼠面朝池壁放入水中，所有受試小鼠選擇同一入水點，記錄60 s內小鼠穿越平臺的次數。每次訓練后將仔鼠用毛巾擦干，放入籠中。

1.4樣品的采集和保存水迷宮結束后次日，對小鼠禁食，用水合氯醛麻醉，摘除眼球法采集血液，放入含有抗凝劑的凍存管中，斷頭處死小鼠，剝離腦組織，在冰上迅速分離海馬組織，用預冷的生理鹽水沖洗，濾紙拭干，樣品保存至-80 ℃冰箱備用。

1.5血鉛含量測定血液樣本經反復凍融后，取400 μL血液加入到2 mL混合酸(體積比為高氯酸硝酸=14)中，經200 ℃加熱消化后，將樣品用無鉛去離子水補足至400 μL，用797伏安極譜儀測定血鉛含量。

1.6海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42水平的測定取一側海馬組織稱重加入預冷的生理鹽水，用玻璃勻漿器冰上研磨10～12 min，制成體積分數10%的海馬組織勻漿，以3 000 r/min離心10 min，取上清按照ELISA試劑盒要求測定Aβ1-40和Aβ1-42水平。

1.7統計學處理實驗數據采用SPSS 21.0進行統計學分析。Morris水迷宮測試中的逃避潛伏期的比較采用重復測量數據的方差分析；各組仔鼠穿越平臺次數、血鉛含量及海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42水平的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1SFN對小鼠空間學習記憶能力的影響結果見表1、2。從表1可以看出，從第2天開始鉛暴露組小鼠的逃避潛伏期均延長；SFN干預組小鼠的逃避潛伏期縮短；各組小鼠的逃避潛伏期有隨時間縮短的趨勢，時間因素和分組因素存在交互作用。從表2可以看出，與對照組相比，鉛暴露組小鼠穿越平臺次數減少；SFN干預組小鼠穿越平臺次數高于鉛暴露組。

表1　各組小鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較(n=10)　s

F組間=33.986，P<0.001；F時間=34.468，P<0.001；F交互=6.104，P=0.003；*：與對照組比較，P<0.05；#：與鉛暴露組比較，P<0.05

表2　各組小鼠穿越平臺次數及血液中鉛含量的比較(n=10)

*：與對照組比較，P<0.05;#：與鉛暴露組比較，P<0.05

2.2SFN對小鼠血液中鉛含量的影響結果見表2。從表2可以看出，與對照組相比，鉛暴露組小鼠血液中鉛的含量升高；SFN干預組小鼠的血鉛含量低于鉛暴露組。

2.3SFN對小鼠海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42水平的影響結果見表3。從表3可以看出，與對照組相比，鉛暴露組小鼠的海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42水平升高；SFN干預組小鼠海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42水平與鉛暴露組相比降低，與對照組相比升高。

表3　各組小鼠海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42水平的比較(n=10)　ng/L

*：與對照組比較，P<0.05;#：與鉛暴露組比較，P<0.05

3　討論

鉛對機體各種組織和器官存在不同的毒性作用，神經系統尤為敏感。嬰幼兒的神經系統正處在發育階段，血腦屏障發育不完善，易受到不良因素的影響，造成智力及神經行為功能缺陷[8]。本研究對未懷孕的雌鼠進行4周的基于飲水的鉛暴露，再合籠產下仔鼠，仔鼠在出生后21 d里通過母乳染鉛，得到發育早期鉛暴露的小鼠模型，觀察SFN的干預效果。

Morris水迷宮實驗結果顯示：無論是前期的定位航行實驗還是最后1 d的空間探索實驗，鉛暴露組小鼠的表現明顯比對照組小鼠差，這與本課題組先前的研究[9]結果一致，而SFN干預組小鼠的表現優于鉛暴露組，這說明SFN可以有效地改善鉛中毒引起的空間學習記憶能力的損傷。

研究[10]表明，孕期和哺乳期會激活母體骨組織內蓄積的鉛，將鉛重新釋放到血液中去，導致血鉛水平升高。另外，當母體血鉛含量增加，母乳中鉛的水平也會升高[11]，對嬰兒造成額外的危害。兒童對于鉛的毒性十分敏感，可以吸收攝入體內的30%～70%的鉛[12]。本研究結果顯示，鉛暴露組小鼠的血鉛含量高于對照組，而SFN干預組小鼠血鉛含量與鉛暴露組相比降低，這提示了SFN可能具有一定的驅鉛效果和降低血液中鉛含量的能力。

Aβ是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)分解而成，APP先后被β-分泌酶和γ-分泌酶剪切成擁有不同氨基酸數量的多肽，最終形成Aβ，最常見的Aβ亞型是Aβ1-40和Aβ1-42。有研究[13]發現鉛可以蓄積在腦組織中，引起Aβ水平升高，從而對神經系統造成損傷。本研究結果與其一致，提示了鉛暴露組學習記憶能力降低可能是由于海馬組織中Aβ水平升高引起。該實驗中鉛暴露小鼠通過SFN干預后海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42的水平明顯降低，證明SFN可以抑制仔鼠海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42的沉積。這與之前的研究得出α-生育酚[14]、EGCG[15]等抗氧化劑能有效改善AD動物中Aβ的沉積這一結果相符。這表明抗氧化劑可以減輕Aβ誘導的氧化損傷，抑制Aβ的沉積，改善神經行為的障礙，可能是治療AD的重要途徑之一。

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