轉染miRNA-129-5p對MCF-7細胞化療敏感性及ABCB1表達的影響

石　瑛，王云鳳，路　璐，任靜靜，馬　丹，魏園玉

1)鄭州大學第三附屬醫院檢驗科 鄭州 450052　2)鄭州大學檢驗系 鄭州 450052

紫杉醇是乳腺癌化療的常用藥物，但化療中常常會出現腫瘤細胞對紫杉醇敏感性降低并最終導致多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，是乳腺癌治療失敗、患者死亡的重要原因之一[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種非編碼RNA,可以同時作用于一種或多種靶mRNA, 根據互補方式的不同降解靶mRNA或者抑制其蛋白的翻譯，并在腫瘤細胞的增殖、凋亡或轉移等生物學行為中發揮重要作用。越來越多的研究[3-7]指出：miRNA-129-5p不僅與胃癌、肝癌、喉鱗狀細胞癌等多種腫瘤的發生與發展有關，同時還參與逆轉腫瘤MDR。通過靶基因預測(http://www.targetscan.org；http://www.mirbase.org)，miRNA-129-5p可能直接靶向MDR相關基因三磷酸腺苷結合盒式結構(ATP-binding cassettes,ABC)轉運蛋白ABCB1。Wu等[8]亦在胃癌細胞系SCG細胞中通過熒光素酶報告基因實驗證實ABCB1是miRNA-129-5p的直接靶基因，且過表達miRNA-129-5p能夠提高胃癌細胞對長春新堿和阿霉素的藥物敏感性。本研究以乳腺癌MCF-7細胞為研究對象，觀察轉染miRNA-129-5p的MCF-7細胞對紫杉醇藥物敏感性的變化，同時觀察MCF-7細胞凋亡相關因子和ABCB1表達的變化，為提高腫瘤化療療效提供新的思路和手段。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器MCF-7細胞購自美國ATCC細胞庫。紫杉醇購自西安昊軒生物科技有限公司，兔抗人Bcl-2和Bax 多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司，鼠抗人ABCB1多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠和羊抗兔IgG、脂質體轉染試劑LipoHigh、總mRNA和miRNA 提取與檢測試劑盒等均購自生工生物工程(上海)有限公司，CCK-8購自日本同仁化學研究所，細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。超靈敏多功能成像儀(Amersham Imager 600)購自美國GE公司，流式細胞檢測儀(BD FACSCanto)購自美國BD公司，全自動熒光定量PCR儀(ABI 7500)購自美國ABI公司。

1.2細胞培養將MCF-7細胞接種于含體積分數10%滅活胎牛血清的RPMI 1640完全培養基中，37 ℃、體積分數5%CO2條件下培養，待細胞處于對數生長期且融合率達80%～90%時，用于后續實驗。

1.3紫杉醇處理和細胞增殖活性檢測取處于對數生長期的細胞，消化后以8×103個/孔接種于96孔板，待細胞貼壁生長且融合度達到60%～70%分別轉染miRNA陰性對照(miRNA-NC)和miRNA-129-5p。轉染24 h后分別加入1.95、3.90、7.81、15.63、31.25、62.50、250.00 nmol/L紫杉醇繼續培養48 h，收獲細胞,采用CCK-8法檢測細胞增殖情況。細胞增殖抑制率=1-(藥物處理組A450 nm-調零孔A450 nm)/(對照組A450 nm-調零孔A450 nm)×100%。每個藥物濃度組設置5個平行復孔，實驗重復3次。

1.4細胞分組與轉染取處于對數生長期的細胞，用胰蛋白酶消化后按3×105個/孔接種于6孔板， 當細胞融合率達70%～80%后分組：空白對照組(常規培養，不做任何處理)、轉染試劑組(僅給予轉染試劑LipoHigh)、miRNA-NC組(轉染miRNA-NC)、miRNA-NC+紫杉醇組、miRNA-129-5p組(轉染miRNA-129-5p)和miRNA-129-5p+紫杉醇組。轉染實驗嚴格按照操作說明書進行，miRNA-129-5p及miRNA-NC陰性對照終濃度均為30 nmol/L，依據預實驗篩選結果，紫杉醇濃度和作用時間取7.81 nmol/L和48 h。

1.5miRNA提取與qRT-PCR采用miRNA抽提試劑盒提取空白對照組、轉染試劑組、miRNA-NC組和miRNA-129-5p組細胞miRNA，所有步驟嚴格按照操作說明書進行。miRNA-129-5p引物序列如下：上游引物5’-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3’；下游引物5’-AAGCCCAGACCGCAAAAAGUU-3’。U6作為內參。逆轉錄條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min；PCR反應體系為20 μL；擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。按2-ΔΔCt方法分析miRNA-129-5p 的相對變化量。每個實驗組設置3個平行復孔，實驗重復3次。

1.6各組細胞凋亡檢測用不含EDTA的胰蛋白酶消化按1.4中分組處理的6組細胞后，用預冷的PBS洗滌1次。加入 Binding buffer重懸細胞，調整細胞密度為106mL-1，每組取100 μL細胞懸液并分別加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，室溫避光15 min；處理后的標本于30 min內上機檢測。采用BD FACSDiva 8.0軟件分析數據。計算早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率。每個實驗組設置3個平行復孔，實驗重復3次。

1.7各組細胞ABCB1、Bcl-2及BaxmRNA檢測

提取6組細胞總mRNA，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。引物(表1)由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反應體系為25 μL，擴增條件： 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。以GAPDH作為內參，按2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。每個實驗組設置3個平行復孔，實驗重復3次。

1.8各組細胞ABCB1、Bcl-2及Bax蛋白檢測用RIPA細胞裂解液裂解各組細胞總蛋白，與5×蛋白上樣緩沖液以體積比41混勻，煮沸5 min，冰上放置10 min。120 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將分離的蛋白轉到PVDF膜，放入含50 g/L脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉1 h后，分別加入鼠抗人ABCB1多克隆抗體(按1500稀釋)，兔抗人Bcl-2、Bax、GAPDH多克隆抗體(均按11 000稀釋)，4 ℃過夜；次日TBST洗滌PVDF膜，分別加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h；TBST再次洗膜， ECL顯色，采用Image J軟件分析目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值，作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

表1　目的基因引物序列及擴增產物長度

F:上游引物；R：下游引物

1.9統計學處理采用SPSS 23.0處理數據。采用單因素方差分析比較6組MCF-7細胞凋亡及ABCB1、Bcl-2和Bax mRNA及蛋白表達水平的差異，兩兩比較用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1miRNA-129-5p對紫杉醇作用下MCF-7細胞增殖的影響結果見表2。

2.2不同組別miRNA-129-5p的相對含量空白對照組、轉染試劑組、miRNA-NC組和miRNA-129-5p組miRNA-129-5p的相對含量分別為：(1.00±0.07) 、(0.93±0.03)、 (1.01±0.06)、(140.67±0.13),4組間相比，差異有統計學意義(F=21.6×105，P<0.001)，與其他3組相比，miRNA-129-5p組miRNA-129-5p的相對含量上調近140倍，說明miRNA-129-5p可以有效轉染入MCF-7細胞。

2.3miRNA-129-5p對紫杉醇作用下MCF-7細胞凋亡的影響與其他各組比較，miRNA-129-5p+紫杉醇組MCF-7細胞早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率均明顯提高，見表3。

2.4各組MCF-7細胞中ABCB1、Bcl-2和BaxmRNA及其蛋白的表達情況見圖1，表4、5。P-gp是由ABCB1基因編碼的藥物轉運蛋白。實驗結果表明：與其他各組比較，miRNA-129-5p+紫杉醇組MCF-7細胞中ABCB1和Bcl-2 mRNA及蛋白的相對表達量降低；而Bax mRNA及蛋白的相對表達量升高。

表2　miRNA-129-5p對紫杉醇作用下MCF-7細胞增殖抑制率的影響(n=3)　%

表3　各組細胞凋亡率的比較(n=3)　%

*：與A、B、C組比較，P<0.05；#：與A、B、C、D組比較，P<0.05；△：與其他5組比較，P<0.05

表4　各組細胞ABCB1、Bcl-2和Bax mRNA的相對表達量(n=3)

*：與A、B、C組比較，P<0.05；#：與A、B、C、D組比較，P<0.05；△：與其他5組比較，P<0.05

1：空白對照組；2：轉染試劑組；3：miRNA-NC組；4：miRNA-NC+紫杉醇組；5：miRNA-129-5p組；6：miRNA-129-5p+紫杉醇組圖1　各組MCF-7細胞中P-gp、Bcl-2和Bax蛋白的表達

表5　各組細胞P-gp、Bax和Bcl-2蛋白的相對表達量(n=3)

*：與A、B、C組比較，P<0.05；#：與A、B、C、D組比較，P<0.05；△：與其他5組比較，P<0.05

3　討論

紫杉醇是重要的抗腫瘤一線化療藥物，而腫瘤細胞耐藥是導致化療失敗的主要原因之一。近年來的研究[3]表明miRNAs與腫瘤耐藥密切相關。已知miRNA通過靶向調控耐藥相關基因的表達提高腫瘤細胞對化學藥物的敏感性，逆轉耐藥并誘導細胞凋亡[9-11]。miRNA-129-5p是定位于染色體7q32的miRNA-129-1和11p11.2的miRNA-129-2的共同轉錄產物，其在多種腫瘤細胞，尤其是耐藥腫瘤細胞株中表達明顯降低[12-14]。而過表達的miRNA-129-5p具有逆轉抗腫瘤藥物耐藥性的作用[15-16]，但是其機制尚不明確。

ABCB1是 ABC轉運蛋白超家族的一員，P-gp是由ABCB1基因編碼的經典的藥物轉運蛋白，起到藥物泵的作用，P-gp過表達可導致藥物外排，降低細胞內有效藥物濃度，同時調節細胞增殖、凋亡和分化等，從而介導腫瘤細胞對紫杉烷類藥物的耐藥[17-18]。靶基因預測與Wu等[8]的研究報道進一步說明miRNA-129-5p可能直接靶向MDR相關基因ABCB1，致ABCB1 mRNA及其蛋白表達受到抑制而提高腫瘤細胞中有效藥物濃度，發揮逆轉耐藥的作用。

本研究采用脂質體轉染技術使MCF-7細胞miRNA-129-5p過表達后用紫杉醇處理，發現細胞增殖抑制率升高，細胞凋亡增多，說明調控miRNA-129-5p在MCF-7細胞中的表達可提高乳腺癌細胞對紫杉醇的敏感性。

Bcl-2和Bax是重要的凋亡相關基因[19-20]。進一步的分析顯示，與miRNA-NC+紫杉醇組相比，miRNA-129-5p+紫杉醇組細胞ABCB1的表達降低，凋亡促進基因Bax的表達升高，凋亡抑制基因Bcl-2的表達降低，說明高表達的miRNA-129-5p有可能抑制耐藥相關基因ABCB1的表達，從而促進細胞凋亡，提高MCF-7細胞對紫杉醇的敏感性。

綜上所述，miRNA-129-5p可能通過下調耐藥相關基因ABCB1的表達提高MCF-7細胞對紫杉醇的敏感性，miRNA-129-5p將來有可能用于治療復發性乳腺癌。

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