沉默S100P對膀胱癌5637細胞生物學特性的影響

田　鑫，趙　輝，李曉東，李鐵強，朱朝陽

1)河南大學淮河醫(yī)院泌尿外科 河南開封 475000　2)河南大學藥學院藥學專業(yè)實驗室 河南開封 475004

膀胱癌是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。在我國，男性膀胱癌發(fā)病率位居泌尿生殖系惡性腫瘤第一位，居全身腫瘤的第八位[1]。膀胱尿路上皮癌約占90%，其中80%為淺表性癌，可行尿道膀胱腫瘤電切+膀胱灌注化療治療，但術后30%～40%腫瘤復發(fā)伴有惡性程度增加或向浸潤性發(fā)展[2-3]。因此，重視膀胱腫瘤的生物學特性，找出膀胱癌易復發(fā)、浸潤、轉移的原因，對于診斷、預防和控制膀胱癌的進展及復發(fā)尤為重要。S100P蛋白是EF手型鈣結合蛋白S100家族的一個新成員，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切[4]。本研究利用RNAi技術沉默人膀胱癌5637細胞中S100P基因的表達，觀察膀胱癌細胞生物學特性及化療敏感性的變化。

1　材料與方法

1.1細胞及主要試劑5637細胞株和293T細胞均由淮河醫(yī)院生物實驗室保存。pLKO.1-TRC載體購自北京科瑞思博生物科技有限公司，慢病毒載體pLKO.1-TRC-S100P由北京擎科生物技術公司合成，S100P siRNA序列為5’-CTTCAGTGAGTTCATCG TGTT-3’， shRNA正向序列為:5’-CCGGCTTCAGT GAGTTCATCGTGTTCTCGAGAACACGATGAACTCAC TGAAGTTTTTG-3’，反向為5’-AATTCAAAAACT TCAGTGAGTTCATCGTGTTCTCGAGAACACGATGAA CTCACTGAAG-3’。用293T細胞包裝慢病毒，制備慢病毒溶液。

1.2實驗分組5637細胞常規(guī)培養(yǎng)于含體積分數10%胎牛血清的雙抗DMEM培養(yǎng)液中。實驗分為空白對照組、陰性對照組和S100P siRNA組，其中S100P siRNA組感染含S100P siRNA的慢病毒，陰性對照組感染空病毒，空白對照組不作處理。

1.3觀測指標

1.3.1S100P mRNA的檢測采用實時熒光定量PCR法檢測。病毒感染48 h后，收集細胞提取總RNA，測定RNA濃度和純度，反轉錄得cDNA，以β-actin為內參，進行RT-PCR。RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，引物由北京擎科生物技術有限公司合成。S100P上游引物序列為5’-TGACGGAACTAGAGACAGCC-3’，下游為5’-GCCACGAACACGATGAACTC-3’；β-actin上游引物序列為5’-CTCACCCTGAAGTACCCCATC-3’，下游為5’-CTTGATCTTCATTGTGCTGGGT-3’。擴增條件：95 ℃30 s變性，60 ℃30 s退火，72 ℃45 s延伸，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCt法計算S100P mRNA的相對表達量。

1.3.2S100P及相關蛋白的檢測采用Western blot法檢測。病毒感染48 h后，收集并裂解細胞，提取總蛋白，采用BCA法測蛋白濃度。分別取40 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，4 ℃封閉過夜，加一抗4 ℃孵育過夜。一抗分別為兔抗S100P單抗(稀釋度1500)，Cyclin D1、P53、NF-kB p65、埃茲蛋白(Ezrin)、P-糖蛋白(P-gp)小鼠單抗(稀釋度均為11 000)，兔抗人β-actin抗體(稀釋度為13 000)，均購自上海Abcam有限公司。加二抗HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠IgG(稀釋度12 000)室溫孵育1 h，化學發(fā)光后顯影。采用Image J 2X計算目的條帶與內參條帶灰度值的比值，即為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.3.3細胞增殖抑制率的檢測病毒感染48 h后，將3組細胞分別用2.5 g/L胰酶消化，制成細胞懸液，以每孔104個接種于96孔板，于37 ℃體積分數5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h后，MTT法檢測細胞增殖情況，每組每個時間點設6個平行孔。MTT試劑盒購自碧云天生物技術研究所，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長490 nm處的吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(空白對照組A值-實驗組A值)/空白對照組A值×100%。實驗重復3次。

1.3.4吡柔比星半數抑制濃度(IC50)的測定病毒感染48 h后，將空白對照組和S100P siRNA組細胞用2.5 g/L胰酶消化，制成細胞懸液，以每孔104個接種于96孔板，于37 ℃體積分數5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，分別加吡柔比星1、10、50、100、200 mg/L處理24 h，MTT法測細胞增殖情況，每組每個濃度5孔。以吡柔比星質量濃度為橫坐標，以細胞增殖抑制率為縱坐標，繪制細胞增殖抑制曲線，計算IC50。實驗重復3次。

1.3.5細胞凋亡率的檢測將3組細胞分別接種于6孔板，每組3個復孔，待細胞生長融合度約為90%時，收集細胞，PBS洗滌，制成細胞懸液。加入Annexin V-FITC混勻，室溫避光約15 min，上機前5 min加入PI，避光混勻，采用CytoFLEX 流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

2　結果

2.1細胞中S100PmRNA和蛋白的表達情況見圖1、表1。可以看出，S100P siRNA組S100P mRNA和蛋白表達水平均較空白對照組和陰性對照組降低，提示S100P siRNA有效沉默了膀胱癌5637細胞中S100P的表達。

2.2細胞增殖抑制率測定結果細胞增殖抑制率的比較見表2。可以看出，S100P siRNA組細胞的增殖抑制率大于陰性對照組，提示沉默S100P可抑制膀胱癌5637細胞的增殖。

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：S100P siRNA組圖1　3組細胞中S100P蛋白的表達

表1　3組細胞中S100P mRNA和蛋白的表達

*與其他兩組比較，P<0.05

表2　S100P siRNA組和陰性對照組細胞增殖抑制率的比較　%

2.3吡柔比星IC50測定結果吡柔比星作用下S100P siRNA組和空白對照組細胞增殖抑制率的比較見表3。吡柔比星處理24 h對S100P siRNA組細胞的IC50為60.04 mg/L，在空白對照組為>200 mg/L，提示沉默S100P能夠增強膀胱癌5637細胞對吡柔比星的化療敏感性。

表3　吡柔比星作用下S100P siRNA組和空白對照組細胞增殖抑制率的比較(n=3)　%

2.43組細胞相關蛋白的表達相關蛋白檢測結果見圖2、表4。結果提示沉默S100P可下調膀胱癌5637細胞中Cyclin D1、CDK2、P53、NF-kB、Ezrin及P-gp蛋白的表達。

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：S100P siRNA組圖2　相關蛋白的表達情況

表4　3組細胞相關蛋白的相對表達量

*與空白對照組和陰性對照組相比，P<0.05

2.53組細胞凋亡率的比較S100P siRNA組、空白對照組、陰性對照組細胞凋亡率分別為(21.1±2.8)%、(8.1±1.6)%和(8.3±1.7)%，3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=87.891，P<0.001)，S100P siRNA組高于其他2組(P<0.05)，提示沉默S100P可促進膀胱癌5637細胞凋亡。

3　討論

膀胱癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因共同參與調控的復雜過程，而影響膀胱癌發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉移過程中的關鍵節(jié)點以及相關基因可成為膀胱癌治療的新靶點。S100P位于多種細胞的細胞質和細胞核內，參與細胞周期進展和分化等多種生物活動，近年來多項研究[5-9]發(fā)現(xiàn)，其在胃癌、膽管癌、乳腺癌及膀胱癌等多種腫瘤組織中表達異常。Higgins等[10]應用cDNA微陣列技術分析發(fā)現(xiàn)，S100P與尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展有關，可用于其診斷及預后評估。韓曉春等[11]發(fā)現(xiàn)S100P在膀胱癌組織中高表達，與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉移關系密切。S100P還可能與癌細胞的化療敏感性有關。過表達S100P能夠增強卵巢癌細胞對鉑類藥物的敏感性[12]，降低包括膀胱癌在內的多種腫瘤細胞(如胰腺癌細胞Panc-1、結腸癌SW480)對5-氟尿嘧啶的敏感性[13]。本研究應用RNAi技術沉默S100P的表達后，膀胱癌5637細胞的增殖能力減弱，凋亡率增加，對吡柔比星的化療敏感性增強。由此可以推測S100P在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有促進細胞增殖，抑制細胞凋亡的作用，并影響細胞對吡柔比星等化療藥物的敏感性。本研究結果還顯示，沉默S100P后，膀胱癌5637細胞中細胞周期相關因子Cyclin D1、CDK2，原癌基因P53、NF-κB、Ezrin蛋白和耐藥相關的P-gp蛋白的表達也降低。推測S100P可能是通過調控這一系列相關蛋白的表達，影響膀胱癌細胞的增殖、侵襲、轉移以及耐藥性。

現(xiàn)有研究[14-16]表明S100P可能是通過與鈣周期結合蛋白、Ezrin、晚期糖基化終末產物(RAGE)等靶蛋白結合，參與多種信號轉導途徑，從而調控腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移。S100P可與細胞周期調節(jié)因子Cyclin D1、CDK2協(xié)同作用，調節(jié)細胞周期，影響癌細胞的增殖[17]；可與RAGE結合，激活NF-κB信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和遷移[18]；其還能夠結合P53，使其失活，從而引起DNA損傷，介導細胞異常增殖[19]；在一定的鈣離子濃度下，S100P可激活Ezrin蛋白，調節(jié)中性粒細胞之間的黏附，促進腫瘤細胞的生長、侵襲和遠處轉移[20]。

綜上所述，S100P的異常表達可能與膀胱癌細胞的增殖、侵襲、轉移及化療療效關系密切，這為靶向沉默S100P基因治療膀胱癌提供了一定的理論基礎。

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