大豆分離蛋白對大鼠阿霉素腎病模型穩定性的影響

朱建立，何美霞，汲振余，張　勇，郭　佳，盛譽妍，郭建成，權松霞，杜　斌

1)鄭州大學醫藥科學研究院 鄭州 450052　2)鄭州大學第一附屬醫院腎內科 鄭州 450052　3)鄭州大學藥學院 鄭州 450052

阿霉素(adriamycin,ADR)腎病動物模型是當今腎病科研領域應用較多的經典模型[1]，該模型的建立與ADR的劑量，給藥途徑、次數、間隔時間，單側腎切除或一側腎動脈鉗夾等因素密切相關[2]。本研究中我們通過在大鼠飼料中添加大豆分離蛋白，復制出成功率高、一致性好、簡便易行的ADR腎病動物模型，并對該模型進行了長期動態觀察，現報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物SPF級雄性SD大鼠，體重130～150 g，購于河南省動物實驗中心，動物許可證號：SCXK(豫)2005-0001。動物實驗操作在鄭州大學醫藥科學研究院動物實驗中心SPF級實驗室完成。室溫22～26 ℃，濕度50%～70%，光照正常，晝夜交替。

1.2實驗方法大鼠適應性喂養1周后，進行尿常規檢測。將檢測結果正常的70只大鼠隨機分為對照組(n=7)、普通飼料組(n=31)和高蛋白飼料組(n=32)。用生理鹽水將ADR (浙江海正藥業股份有限公司，批號100501)配制為0.2 g/mL的溶液，參考文獻[3]，普通飼料組和高蛋白飼料組第1次按4.0 mg/kg的用量由尾靜脈注射ADR，1周后按3.5 mg/kg的用量再次注射ADR；對照組注射等量的生理鹽水；高蛋白飼料組大鼠從第1次注射ADR起，給予2周高蛋白飼料喂養，此后改為普通飼料喂養；普通飼料組和對照組大鼠始終采用大鼠全價顆粒飼料和無菌水喂養。全價顆粒飼料經河南省農科院質標中心檢驗粗蛋白含量為24.87%，高蛋白飼料是在全價顆粒飼料中加入占比為20%的大豆分離蛋白(湖北省云夢龍云蛋白食品有限公司，批號：20120321-5)，粗蛋白含量32.68%。

1.3觀察指標①記錄3組大鼠造模18 d后的存活率。②24 h尿蛋白總量(24 h Pro)：從首次注射ADR起至第18天每天收集24 h 尿液，測定尿液體積，采用磺基水楊酸-硫酸鈉法測定24 h Pro， 24 h Pro>30 mg者計入ADR腎病模型；并于造模前，造模24、31、38、45和52 d，同法測定對照組和高蛋白飼料組大鼠的24 h Pro，進行動態觀察。③后肢足掌厚度：造模24、31、38、45和52 d，測量對照組和高蛋白飼料組大鼠左后肢足掌的厚度(mm)，減去造模前的數值，計算厚度變化的百分數，作為水腫程度變化的標志。④血清白蛋白和腎功能水平：造模前，造模24、31、38、45和52 d，對照組和高蛋白飼料組大鼠眶后靜脈叢取血，檢測血清白蛋白和血清尿素氮水平。⑤腎臟組織形態學觀察：造模24 d后，隨機抽取對照組和高蛋白飼料組大鼠各1只，處死，取腎臟，切片厚度為3 μm。進行碘酸雪夫染色(PAS)，PAS試劑盒由福州邁新生物技術開發有限公司提供。光鏡下觀察腎小球組織結構。用透射電鏡(TEM)觀察腎小球足突結構和基底膜。實驗結束時(造模52 d)，取2組動物雙側腎臟，分離包膜后稱重，計算臟器系數(雙側腎臟重量/體重×100%)。

1.4統計學處理動物造模18 d，3組大鼠24 h Pro水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；不同時間點小鼠24 h pro、水腫程度、血清白蛋白和尿素氮的變化采用重復測量數據的方差分析；實驗結束，對照組和高蛋白飼料組臟器系數的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1造模18d后3組大鼠的存活率和24hpro比較對照組和高蛋白飼料組大鼠的存活率均為100%；普通飼料組大鼠自注射ADR后第12天死亡4只，第13天死亡4只，第14天死亡3只，第15天死亡1只，第16天死亡4只，至第18天時累計死亡16只，存活率為50%，說明給予ADR建模飼喂普通飼料大鼠死亡率高，以下著重觀察建模后給予高蛋白飼料的大鼠與正常對照各指標的差異。動物造模18 d，對照組、普通飼料組和高蛋白飼料組大鼠24 h Pro分別為(7.1±1.4)、(115.6±84.0)和(33.5±3.6) mg，3組相比，差異有統計學意義(F=8.139，P=0.004)；與對照組相比，普通飼料組和高蛋白飼料組大鼠24 h Pro均升高(P均<0.05)；同時普通飼料組高于高蛋白飼料組(P<0.01)，且前者24 h Pro所測得數值的標準差遠大于后者。

2.22組大鼠不同時期24hPro的變化結果見表1。由表1可知，造模24 d高蛋白飼料組大鼠24 h Pro隨著觀察時間的延長而升高，且高于對照組。

表1　2組大鼠不同時期24 h Pro的變化　mg

F組間=3 705.105,F時間=559.219,F交互=549.318,P均<0.001；*：與對照組比較，P<0.05

2.32組大鼠不同時期水腫程度的變化結果見表2。由表2可知，造模24 d，與對照組相比，高蛋白飼料組大鼠表現出明顯的水腫，且隨著觀察時間的延長水腫逐漸加重。

表2　2組大鼠不同時期水腫程度的變化　%

F組間=4 756.500,F時間=71.890,F交互=49.953,P均<0.001；*：與對照組比較，P<0.05

2.42組大鼠不同時期血清白蛋白和尿素氮水平比較結果見表3、4。與對照組相比，高蛋白飼料組大鼠在造模24 d后血清白蛋白水平降低，之后持續降低；與對照組相比，高蛋白飼料組動物大鼠血清尿素氮水平在給藥后39 d開始升高。

表3　2組大鼠不同時期血清白蛋白水平的比較　g/L

F組間=90.749,F時間=9.081,F交互=11.523,P均<0.001；*：與對照組比較，P<0.05

表4　2組大鼠不同時期尿素氮水平的比較　mmol/L

F組間=59.345,F時間=54.255,F交互=58.265,P均<0.001；*：與對照組比較，P均<0.05

2.5腎臟組織形態學觀察實驗結束時，對照組、高蛋白飼料組動物的臟器系數分別是(0.74±0.04)、(1.29±0.18)，后者高于前者(t=7.248，P<0.01)。2組腎組織電鏡結果如圖1上排所示。造模24 d，對照組腎小球各結構無病變，足細胞足突清晰、明顯，腎小球基底膜完整，均勻一致，高蛋白飼料組足細胞足突發生部分融合，基底膜厚度不均一；實驗結束時對照組腎小球足細胞足突正常，腎小球基底膜完整，均勻一致，高蛋白飼料組可見足突廣泛融合、裂隙消失，基底膜顯著增厚。 PAS染色結果如圖1下排所示。造模24 d，光鏡下對照組未見異常，高蛋白飼料組腎小球未見病變，但腎小管管腔腫脹，有顆粒變性；實驗結束時光鏡下對照組腎小球、腎小管和間質均未見結構異常，高蛋白飼料組可見腎小球基底膜節段增厚，球囊粘連，呈現顯著的腎小球節段性硬化，腎小管上皮細胞層空泡變性，存在大量蛋白管型。

1：電鏡，標尺1 900.00 nm；2：腎臟PAS(×400)；A、B:造模24 d的對照組和高蛋白飼料組；C、D:實驗結束時的對照組和高蛋白飼料組圖1　各組大鼠腎組織電鏡觀察和PAS結果

3　討論

ADR是含醌的蒽環抗生素，在臨床上作為腫瘤化療藥物廣泛應用,可在腎臟內代謝還原為半醌型自由基。后者與氧反應產生活性氧，誘發腎小球上皮細胞脂質過氧化反應，破壞濾過膜的結構和功能，導致膜濾過屏障的選擇性變化而引起蛋白尿[4]。ADR的腎毒性及大量蛋白尿的產生進一步誘發腎小球內固有細胞及其他炎性細胞產生并釋放各種細胞因子和炎性介質，刺激腎小球系膜細胞增殖和系膜基質增多，緩慢發展形成腎小球硬化[5-6]。以上研究結果提示ADR誘導腎病具有慢性和自我進展的特性，這也是人類慢性進展性腎病的特征。根據ADR對腎臟毒性的特點，實驗研究中可分為急性腎病模型和慢性腎病模型。急性腎病模型類似于人微小病變型腎病,而慢性腎病模型類似于人慢性腎小球腎炎和局灶節段性腎小球硬化。

許多因素會影響ADR腎病模型的穩定性。提高模型成功率和降低動物個體差異是動物疾病模型復制過程中需要解決的兩個問題。我們在預實驗中曾采用與本研究報道同批次的ADR第1次尾靜脈注射4.0 mg/kg，間隔1周，注射相同劑量的ADR，雖然在20 d后模型成功率可達90%，但后期用藥期間，模型大鼠因ADR的嚴重毒性，一直持續腹瀉，且經常出現口鼻出血現象，死亡率高、動物個體間24 h Pro差別也比較大。即使將第2次注射ADR的劑量減低到3.5 mg/kg，動物腹瀉減少，但仍然出現動物死亡率高、動物個體間24 h Pro差別大的問題。后來經過多次反復試驗，發現在飼料中添加20%大豆分離蛋白可以顯著提高動物的存活率，不僅如此，模型動物個體間24 h Pro的差異亦明顯減少，這對于后期研究十分有利。據報道[7-9]，大豆分離蛋白有減少脂質在肝臟中的積累，加強排泄和抑制脂肪吸收，減緩實驗動物和受試者的腎損傷進展，降低血壓，改善血脂水平的作用。對于5/6腎臟切除大鼠模型，大豆分離蛋白可以有效降低血壓和膽固醇，并具有減輕腎臟損傷的作用，對于人的2型糖尿病和腎病也有減輕尿蛋白和改善血脂的作用。此外，據報道[10-11]，大豆分離蛋白可以改善血脂異常的胰島素抵抗模型大鼠脂肪組織功能障礙，改善糖尿病大鼠氧化應激。而大豆分離蛋白對腎臟損傷的保護作用是否與其抗氧化作用有關，有待進一步研究探討。

我們通過電鏡觀察到高蛋白飼料組自第1次給ADR后24 d，24 h Pro大于30 mg時，光鏡下可見腎小球正常，電鏡下可見足細胞足突足發生部分融合，基底膜厚度不均一，說明大鼠有類似臨床患者的微小病變型腎病。在此基礎之上，我們又繼續動態觀察了4周，發現高蛋白飼料組大鼠24 h Pro持續增加，從造模24 d時的36.7 mg逐漸增至293.5 mg；血清白蛋白則持續降低，第39天起血清尿素氮顯著升高；水腫也更加明顯，可見隨著觀察時間的延長，各種癥狀逐漸加重， ADR的毒性呈現漸進性增加；在實驗結束，即造模第52天通過電鏡觀察到足突廣泛融合、消失，基底膜明顯增厚。說明動物出現了腎小球節段性硬化的病變。我們也對該模型進行了長達5個月的觀察，發現模型動物在觀察期間24 h Pro持續升高，腎小球節段性硬化的病變更加惡化。當然該模型在應用中還應注意ADR的批次不同，其24 h Pro會有所差異，所以需要做預實驗來確定ADR的劑量，同時ADR易滲漏到血管外引起組織壞死，也使得進入動物體內的ADR的量不準確，所以熟練掌握大鼠尾靜脈注射也是十分必要的。

總之，本研究通過兩次給予ADR后在動物飼料中添加大豆分離蛋白構建大鼠ADR腎病模型，操作簡便，建模時間短，成功率高；模型大鼠間24 h Pro等指標變異小，重復性和穩定性好；該模型大鼠的病變時間長，病情持續加重，有利于動態觀察慢性腎病的進展和變化，為腎病研究以及新藥作用觀察提供了基礎。

致謝：感謝鄭州大學醫藥科學研究院代麗萍教授在數據統計處理方面給予的指導。

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