非CAG三核苷酸異常擴增相關脊髓小腦共濟失調患者CACNA1A基因突變分析

張　槊，楊志華，劉玉濤，駱海洋，唐秘博，楊　靖，王燕琳，史長河，許予明

鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

脊髓小腦性共濟失調(spinocerebellar ataxia, SCA)是一組具有臨床及遺傳異質性的神經退行性疾病[1]，主要累及小腦及相關神經傳入傳出通路，臨床上以小腦性共濟失調為主要特征，伴有錐體系及錐體外系疾病癥狀[2]。其遺傳方式以常染色體顯性遺傳為主，目前已有至少44個基因或位點被確定與SCA的發病相關(http://neuromuscular.wustl.edu/ataxia/domatax.html)。CAG三核苷酸重復所致的SCA亞型，如SCA1，2，3，6，7，17和齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(DRPLA)占所有SCA病例的50%以上，但是其他一些常規的基因所導致的SCA則較少報道[1]。與CAG異常擴增所致的SCA相比，其他基因所引起的共濟失調多表現為疾病進展緩慢，生存期長，致殘率低等特點[1]。CACNA1A(NM_000068.3)編碼神經元電壓依賴性的P/Q型鈣通道α-1亞基(Cav2.1)，該亞基參與調控鈣離子調控進入細胞并在多種鈣離子調控的生命活動中有著重要作用，比如基因表達、神經遞質釋放等[3]。CACNA1A在小腦及大腦中廣泛表達[4]。既往研究報道CACNA1A變異參與SCA6型(SCA6)[5]、發作性共濟失調2型(episodic ataxia type 2, EA2)[6]、家族性偏癱型偏頭痛(familial hemiplegic migraine, FHM)[7]的致病機制。SCA6是由CACNA1A的第1號外顯子中編碼谷氨酰胺的三核苷酸CAG過度擴增所致異常蛋白引起[5]，FHM和EA2則主要是由該基因的點突變所致[8-11]。近年來研究[12]報道CACNA1A除參與以上3種疾病以外，還可以通過該基因的點突變等引起SCA。Coutelier 等[13]報道CACNA1A是SCA中除包含CAG重復各基因以外的最常見的致病基因。為了解CACNA1A基因在中國SCA患者中的突變情況，本研究應用PCR結合DNA序列分析方法，對初步排除包含CAG重復基因的68例SCA家系先證者進行了CACNA1A基因的突變分析，現將結果報道如下。

1　對象與方法

1.1研究對象鄭州大學第一附屬醫院神經內科2010年6月至2016年6月所收集的68例SCA家系的先證者，均已排除CAG重復擴增的亞型SCA1，2，3，6，7，17和DRPLA。由兩名神經內科醫師進行詳細的病史采集、神經系統查體，詳細詢問家族史，完善影像學等檢查。同時收集該院2015年1月至2016年6月200名無神經精神系統疾病的健康志愿者為對照。研究得到鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準，并取得受試者的知情同意。

1.2基因測序及產物分析取患者及健康志愿者外周靜脈血5～10 mL，抗凝，抽提基因組DNA。根據NCBI網站CACNA1A外顯子序列，應用Primer 6設計引物(表1)，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。PCR反應體系為30 μL：DNA模板2 μL，正、反向引物(20 μmol/L)各1 μL，2×Taq PCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)15 μL，超純水11 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性1 min，應用touchdown的方式退火1 min，72 ℃延伸 1 min，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃存放。取10 μL反應產物在20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，之后進行goldview染色并在紫外線下觀察結果。將上述PCR產物送至華大基因直接測序。測序結果應用Chromas軟件分析，并與人類基因組基因(GenBank序列號 NC_000019.10)比對。將篩選到的可能致病位點在200名健康志愿者中依照前述PCR擴增及測序方法進行驗證。

表1　CACNA1A引物列表

續表1

2　結果

2.1CACNA1A基因的測序結果對68例SCA家系先證者進行測序檢測后，在1例先證者(圖1)中檢出CACNA1A基因第19號外顯子2 992位到2 997位堿基發生GAGGGC缺失變異，該突變導致其所編碼蛋白Cav2.1第998谷氨酸和999位甘氨酸發生缺失(圖2)。在200名健康志愿者中未發現該突變位點。

2.2臨床資料及輔助檢查結果先證者(Ⅱ-3)，女，33歲，以“走路不穩”為主訴入院。4 a前無明顯誘因出現走路不穩，寬基底步態，步速較前減慢，伴言語不利，構音障礙，后出現間斷性雙手及頭部不自主抖動，運動或靜止時均可出現，發病以來，記憶力略有減退。神經系統查體示：右上肢肌力5級，左上肢肌力近端5級、遠端4級，雙下肢肌力近端4級、遠端4級；四肢肌張力正常，深淺感覺未見異常；深反射正常，四肢病理征陰性。頭部MRI示小腦萎縮(圖3)。該家系中先證者的父親(Ⅰ-1)患有同樣疾病，于33歲發病，臨床表現為走路不穩，雙手及頭部不自主抖動。但由于先證者的父親于43歲時去世，我們未能獲得更多的臨床資料。

圖1　家系系譜圖

圖2　CACNA1A突變測序(箭頭所示為堿基缺失位點)

A:軸位，B:矢狀位圖3　頭顱MRI

3　討論

CACNA1A基因位于19號染色體，編碼神經元電壓依賴性的P/Q型鈣離子通道α-1亞基CaV2.1。CaV2.1作為一種電壓門控鈣離子通道，廣泛分布于大腦、海馬、小腦和脊髓神經元的突觸前膜和樹突[14-16]，并調節神經元突觸囊泡的釋放[17-19]。在小腦中，CaV2.1門控通道參與調控蒲肯野細胞和顆粒細胞的鈣離子流及細胞活性[20-21]。此外，小腦蒲肯野細胞或顆粒細胞中CACNA1A的敲除可以導致蒲肯野細胞的活性下降進而引起小腦功能的改變[22-23]。

這些研究表明CACNA1A在調節蒲肯野細胞活性及小腦功能中發揮著重要作用。

近年來CACNA1A基因除了CAG重復次數異常擴增以外,其他變異如點突變等導致SCA亦有報道[12,24-25]。中國曾有研究[26]報道CACNA1A第25號外顯子c.G4034GA (p.R1345Q)點突變可以導致共濟失調并伴有震顫。此外，另有研究[13]報道CACNA1A基因點突變等變異是SCA中除CAG重復異常擴增基因如ataxin 1、ataxin 2、ataxin 3等以外出現頻率最高的致病原因。這些證據表明CACNA1A在SCA的發病中有著重要作用，在中國SCA患者中進行CACNA1A基因的檢測顯得很有必要。

本研究在來自中國的SCA家系的1例先證者中發現了一個CACNA1A基因的缺失型變異，c.2992-2997del(p.Glu998-Gly999del)。該患者表現為緩慢進展的走路不穩，構音障礙，并伴有手和頭部的不自主抖動，同時影像學表現為小腦萎縮。其臨床表現區別于SCA6患者，SCA6患者除共濟失調以外，多伴隨有嚴重的吞咽障礙、復視、錐體束征等；同時也區別于EA2，該病多表現為間歇發作的共濟失調，尤其是在疾病的初始階段[6]。一系列研究報道CACNA1A突變可以導致共濟失調：S218L突變可以導致共濟失調并表現有癲癇癥狀[27-28]；R1352Q突變則表現為早發型共濟失調并伴有偏頭痛[12]。故可以認為CACNA1A變異在SCA發病中有著重要的作用，雖然不同位點的突變所導致的癥狀有很大差異。這些不同可能是因為突變所導致的蛋白構象改變或是相關遺傳因子的影響。所以，CACNA1A基因序列的測定將進一步完善SCA的基因診斷，尤其是排除CAG異常擴增之后。

研究[3]表明，CACNA1A的變異可導致CaV2.1蛋白的穩定性和離子通道的活性下降。本研究中的CACNA1A基因的缺失變異導致CaV2.1蛋白第998位谷氨酸和999位甘氨酸的缺失，其可能導致CaV2.1生理功能的損傷。堿基缺失所致的非框移突變引起共濟失調的情況在其他基因中也有報道，如一個日本的SCA5家系就是由SPTBN2基因的c.2608_2610delGAG缺失所致，該缺失導致所編碼蛋白第870位谷氨酸發生缺失[29]。但是，CACNA1A的缺失型變異導致共濟失調的致病機制仍需要進一步的探索。

綜上所述，我們在68例來自SCA家系的先證者中發現了1例CACNA1A基因第19號外顯子第2 992位到2 997位堿基發生GAGGGC缺失變異，引起Cav2.1第998位谷氨酸和999位甘氨酸發生缺失。盡管CACNA1A基因突變比例較小，但該研究結果豐富了SCA致病基因數據庫，提示進行SCA基因篩查時勿遺漏CACNA1A基因檢測。

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