低氧對滋養細胞HIF-1α、BNIP3表達及自噬和侵襲能力的影響

閆廣偉，丁燕子，邢金芳，代延朋，杜紅梅，袁恩武

鄭州大學第三附屬醫院檢驗科 鄭州 450052

滋養細胞由妊娠初期胚胎外胚層細胞衍生而來，可分為細胞滋養細胞、合體滋養細胞和中間型滋養細胞，其中細胞滋養細胞為滋養干細胞，隨著妊娠的形成分化發育成絨毛滋養細胞和絨毛膜外滋養細胞兩種類型[1]。絨毛膜外滋養細胞可以侵入子宮螺旋動脈和血管內皮，子宮螺旋動脈重鑄能夠保證足夠的胎盤灌流維持正常妊娠。妊娠早期胎盤發育處于相對低氧(2%～5%氧濃度)環境，蛻膜組織氧濃度在8%左右[2]，而此時氧濃度是影響滋養細胞侵襲性的關鍵因素。作為胎盤的主要成分，低氧條件下滋養細胞的增殖、分化、侵襲性等生理功能的變化受眾多信號通路的調節，滋養細胞侵襲功能障礙可導致子癇前期、胎兒生長受限、流產等疾病[3-4]。自噬是一種存在于真核細胞中依賴溶酶體途徑消化降解自身成分的過程，微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)和Beclin 1是兩個重要的自噬相關分子，檢測二者的表達可以判斷細胞自噬的活性[5]。研究[6-7]表明，胎盤細胞自噬在維持正常妊娠過程起重要作用，自噬過度或自噬不足與多種妊娠期疾病有關。滋養細胞自噬同樣受到眾多信號通路的調節，研究[8]顯示缺氧條件下原代培養滋養細胞自噬水平增強，然而低氧誘導滋養細胞自噬的分子機制尚不完全明了。本研究以絨毛膜外滋養細胞HTR-8/SVneo為研究對象，采用缺氧和自噬抑制劑3-MA處理滋養細胞，對HIF-1α/BNIP3信號通路的關鍵因子進行檢測，探討低氧對滋養細胞自噬和侵襲性的影響及其機制，為妊娠期缺氧性相關疾病的研究提供理論依據和新的思路。

1　材料與方法

1.1主要試劑RPMI 1640培養基購自北京索萊寶公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰蛋白酶購自美國HyClone公司，自噬抑制劑3-MA為美國Selleck公司產品，熒光定量試劑盒SYBI Green購自日本TOYOBO公司，Transwell小室購自Corning Costar公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司，HIF-1α、BNIP3兔抗人一抗購自美國Abcam公司，LC3、Beclin 1兔抗人一抗購自美國CST公司。滋養細胞株HTR-8/SVneo購自美國ATCC公司。

1.2細胞培養及實驗分組將HTR-8/SVneo細胞置于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，37 ℃、體積分數5%二氧化碳培養箱中培養，每2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞進行后續實驗。細胞以105mL-1的密度接種于6孔板，每孔2 mL，待細胞達70%融合時更換無血清培養基培養24 h后分為3組：常氧組在正常條件下培養細胞，缺氧組加入終濃度為200 μmol/L 的CoCl2，3-MA+缺氧組在缺氧組基礎上加入終濃度為5 mmol/L 3-MA。繼續培養24 h后進行1.3和1.4的檢測。

1.3Real-timePCR檢測HIF-1α、BNIP3mRNA的表達量Trizol一步法提取常氧組和缺氧組細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，置于熒光定量PCR儀進行擴增，擴增體系為20 μL。擴增條件為95 ℃預變性60 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s,共40個循環。PCR引物(表1)由上海生物工程有限公司設計合成。采用2-ΔΔCT法計算HIF-1α、BNIP3 mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

表1　Real-time PCR擴增引物序列及擴增片段長度

F:上游引物；R:下游引物

1.4Westernblot檢測HIF-1α、BNIP3、Beclin1和LC3蛋白表達量收集常氧組和缺氧組細胞,用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，之后經轉膜、封閉后加入按比例稀釋后HIF-1α、BNIP3一抗(按11 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，第2天取出室溫平衡后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(按110 000稀釋)，室溫避光孵育1 h，1×TBST洗膜3遍，ECL化學發光檢測，最后采用Odyssey Clx紅外熒光掃描成像系統分析目的條帶。另取3組細胞，同上測Beclin 1、LC3蛋白表達量。實驗重復3次。

1.5Transwell實驗檢測細胞侵襲力在Transwell小室內加入100 μL按照18稀釋的Matrigel基質膠，將小室放入24孔板內置恒溫培養箱孵育4 h，上室加入200 μL細胞懸液(細胞密度為5×105mL-1)，下室加入600 μL含體積分數10% 胎牛血清的RPMI 1640培養基，放入恒溫培養箱，待細胞貼壁后，上室按照分組加入CoCl2、3-MA或不處理，置37 ℃、體積分數5%二氧化碳培養箱繼續培養24 h，取出24孔板，用棉簽輕輕擦去上室培養基和未穿透細胞，PBS溶液輕輕沖洗3遍后，用體積分數4%甲醇固定30 min，在小室內加入蘇木精染色15 min，置倒置顯微鏡(×400)下觀察，拍照并計數，每個Transwell小室計數5個視野。

1.6統計學處理應用SPSS 17.0處理數據。采用兩獨立樣本t檢驗比較常氧組和缺氧組HIF-1α、BNIP3 mRNA和蛋白表達水平的差異，采用單因素方差分析比較常氧組、缺氧組和3-MA+缺氧組Beclin 1和LC3蛋白的表達水平及侵襲細胞數的差異,兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1缺氧對滋養細胞HIF-1α、BNIP3mRNA及蛋白表達的影響Real-time PCR結果顯示：與常氧組相比，缺氧處理24 h后滋養細胞HTR-8/SVneo中HIF-1α mRNA表達水平無明顯變化，BNIP3 mRNA表達水平升高，HIF-1α、BNIP3蛋白表達水平均上調，見圖1、表2。

1：常氧組；2：缺氧組圖1　缺氧后滋養細胞HIF-1α及BNIP3蛋白的表達

表2　缺氧條件下滋養細胞HIF-1α、BNIP3 mRNA和蛋白的表達

2.2缺氧和3-MA對滋養細胞LC3、Beclin1蛋白表達的影響與常氧組相比，經缺氧處理24 h后，滋養細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表達水平升高；與缺氧組相比，3-MA+缺氧組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平降低，同時Beclin 1蛋白表達水平下降(圖2、表3)。

1：常氧組；2：缺氧組；3：3-MA+缺氧組圖2　3組滋養細胞Beclin 1、LC3蛋白的表達

2.3缺氧和3-MA對滋養細胞侵襲力的影響缺氧組侵襲細胞數高于常氧組，但在缺氧條件下使用自噬抑制劑3-MA后侵襲細胞數減少(圖3、表3)。

A：常氧組；B：缺氧組；C：3-MA+缺氧組圖3　3組滋養細胞侵襲細胞數比較(×400)

表3　3組滋養細胞Beclin 1、LC3蛋白的表達水平及侵襲細胞數的比較

*:與常氧組相比，P<0.05；#:與缺氧組相比，P<0.05

3　討論

妊娠期胎盤是維持胎兒宮內生長發育的重要器官，胎盤是母體與胎兒進行氧交換和二氧化碳交換的主要場所。本課題組前期研究[9]顯示稽留流產胎盤絨毛組織滋養層細胞自噬標志物LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達比值下降，同時HIF-1α/BNIP3信號通路在這個過程中起重要作用 。Wu等[4]的研究表明滋養細胞侵襲力的改變可能是流產發生發展的重要機制。正常妊娠12周后，絨毛膜外滋養細胞可侵入子宮螺旋動脈取代其血管內皮細胞，參與平滑肌細胞的降解[10]，在胚胎植入、胎兒發育、建立有效的母胎循環過程中發揮至關重要的作用。

HIF-1α是細胞內的一種轉錄因子，與HIF-1β構成異二聚體，可調控100多種靶基因的表達，在調節血管形成、胎盤和胚胎發育、糖代謝及細胞凋亡和自噬過程中扮演重要角色。Dubinsky等[11]研究發現HIF-1α在滋養層細胞中表達，參與控制了滋養層細胞的侵入和遷移。研究[12]已證實BNIP3參與細胞凋亡、自噬和細胞壞死等過程；BNIP3在機體缺氧條件下會急劇升高，其表達受HIF-1α的調控。本研究以絨毛膜外滋養細胞HTR-8/SVneo為研究對象，采用CoCl2處理模擬細胞缺氧模型[13]，結果顯示缺氧處理24 h后HIF-1α、BNIP3蛋白及BNIP3 mRNA的表達水平均升高，但HIF-1α mRNA的表達水平無明顯改變。

LC3是自噬體膜上重要的標記蛋白，它在細胞內以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種形式存在。在自噬發生過程中， LC3Ⅰ轉化為LC3Ⅱ并定位于自噬體膜，因此LC3Ⅱ/Ⅰ可以反映自噬水平的高低[14]。Beclin 1是酵母ATG6/Vps30基因在哺乳動物中的同源物，位于人類染色體17q21，主要通過與ClassⅢ PI3K和Atg14L結合形成復合體調控自噬體的形成[15]。低氧條件下，活化的HIF-1α通過上調BNIP3將Beclin 1從Beclin 1/Bcl-2復合體解離釋放，激活自噬[16]。本研究結果顯示滋養細胞缺氧后，自噬標志蛋白Beclin 1及 LC3Ⅱ/Ⅰ表達均升高，而加用自噬抑制劑3-MA后滋養細胞Beclin 1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平降低。這一發現表明缺氧可誘導滋養細胞自噬的發生，HIF-1α/BNIP3途徑可能在此過程中起重要作用。

滋養細胞的侵襲、浸潤是一個多因素參與調節、多步驟的復雜過程。有研究[17]顯示缺氧條件下人絨毛膜外滋養細胞MMP-2表達升高并使細胞侵襲力增強，同時MMP-9和TIMP-1表達升高；缺氧可通過MMP-9/TIMP-1來調節細胞侵襲性。Maltepe等[18]研究發現，滋養細胞在低氧條件下可以通過激活HIF-1α影響其侵襲能力。研究[19-20]顯示，腫瘤細胞自噬與其侵襲性存在復雜關系，然而自噬與滋養細胞侵襲性的相關研究國內外較少。本研究結果顯示，HTR-8/SVneo細胞缺氧24 h后侵襲細胞數量比常氧組增多，此外，自噬抑制劑3-MA對缺氧后滋養細胞侵襲力有抑制作用，這表明自噬抑制劑可能通過抑制缺氧誘導的自噬從而影響滋養細胞的侵襲能力。結合前期研究，我們推測在低氧環境中，稽留流產患者絨毛滋養層細胞自噬減弱，滋養細胞處于低浸潤能力狀態,不足以應對缺氧環境帶來的壓力，無法正常促進胚泡植入和胎盤形成，從而導致胚胎停止發育，發生稽留流產[9]。

綜上所述，低氧可能通過HIF-1α/BNIP3途徑誘導滋養細胞自噬并影響其侵襲能力，自噬抑制劑3-MA通過抑制低氧條件下滋養細胞自噬的發生從而降低其侵襲性。缺氧環境中滋養細胞自噬、侵襲性和妊娠期相關疾病之間存在錯綜復雜的關系，仍需進一步深入研究。

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