二氧化鈰納米顆粒預處理對大鼠缺血再灌注損傷心肌細胞Nrf2信號通路的影響

黃真鋒，法憲恩，朱方濤，王宏山，高成山，柳　兵

1)鄭州大學第二附屬醫院心臟大血管外科 鄭州 450014　2)鄭州市第七人民醫院心臟大血管外科 鄭州 450000

缺血再灌注除可引起心肌缺血損傷，還可引起超微結構、代謝、功能和電生理方面的一系列損傷,稱為缺血-再灌注(ischemia-reperfusion, IR)損傷[1]。既往研究[2]顯示，二氧化鈰納米顆粒(nanoceria)預處理能減輕大鼠IR心肌的氧化應激損傷反應，表現出較好的心肌保護效果。本研究旨在從基因和蛋白水平研究nanoceria對核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、相關基因醌氧化還原酶1(NQO1)及血紅素氧化酶1(HO-1)表達的影響， 探討其心肌保護作用的可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物和主要材料健康成年雄性SD大鼠50只，購自河南省實驗動物中心，體重250～280 g，根據鄭州大學動物倫理要求處理實驗動物。RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，抗大鼠Nrf2單抗購自Abcam公司，RT-PCR試劑盒購自北京全式金生物技術公司。1～10 nm粒徑nanoceria購自美國Sciventions公司(批號191CO)，10～25 nm粒徑nanoceria購自美國Sigma公司(批號554841)，50 nm粒徑nanoceria購自北京納辰科技發展有限責任公司(批號NP422-1)。

1.2實驗分組將50只SD大鼠隨機分組：假手術組、模型組、nanoceria預處理1～3組，每組10只。模型組：參考呂瑞濤等[2]方法建立心肌IR大鼠模型，心肌缺血45 min末剪斷結扎線取出乳膠小管，恢復冠狀動脈血流，缺血部位心肌顏色恢復為模型成功，再灌注時長為120 min。nanoceria預處理1～3組：分別將1～10、10～25和50 nm粒徑的nanoceria溶解于PBS緩沖液中，配制成1 g/L的懸液,于術前24 h經尾靜脈注射(2 mL/kg)，其余步驟同模型組。假手術組：大鼠術前24 h經尾靜脈注入PBS緩沖液(2 mL/kg)；術中開胸后，于心臟左前降支處只穿線，不結扎冠狀動脈，其余操作同模型組。

1.3標本采集再灌注結束后取出大鼠心臟并立即置于4 ℃生理鹽水中，排凈心腔中血液，剪取左前降支結扎線遠端再灌注區位置的心肌組織，快速放入-80 ℃冰箱中保存。

1.4心肌組織中Nrf2、NQO1、HO-1mRNA的檢測按照試劑說明，Trizol法提取標本心肌組織中的總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳法進行鑒定,用反轉錄試劑盒合成cDNA。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，Nrf2引物序列：正義鏈為5’-CACTCTGTGGAGTCTTCCA-3’,反義鏈為5’-GAATGTGTTGGCTGTGCTTTA-3’；NQO1：正義鏈為5’-GTGGTCGAATCTGACCTCTA-3’，反義鏈為5’-GAATCCTGCCTGGAAGTTTA-3’；HO-1：正義鏈為5’-GGAGATAGAGCGAAACAAGCAGAA-3’，反義鏈為5’-CACGGTCGCCAACAGGAAA-3’；β-actin：正義鏈為5’-CATCCTGCGTCTGGACCT-3’，反義鏈為5’-TCAG GAGGAGCAATGATCTTG-3’。反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共30個循環。產物于15 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，用全自動凝膠成像及分析系統分析，用2-ΔΔCt法計算目的mRNA的表達水平。

1.5心肌細胞核內Nrf2蛋白的檢測采用Western blot法檢測。用EDTA處理心肌細胞，PBS清洗2次，用細胞核蛋白抽提試劑盒按說明書抽提心肌細胞核蛋白。制備SDS-PAGE 凝膠，轉膜后上樣胞核蛋白，檢測其中Nrf2蛋白的表達量，用圖像軟件分析目的條帶光密度，以目的條帶與對照光密度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.6統計學處理應用SPSS 21.0分析數據，5組心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA及Nrf2蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1mRNA的表達見表1。模型組HO-1、NQO1 mRNA的表達水平較假手術組升高，而Nrf2 mRNA表達水平兩組無明顯差異。Nanoceria預處理組Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達水平均較模型組升高，其中Nanoceria預處理2組表達水平最高。

2.2大鼠心肌細胞胞核內Nrf2蛋白的表達具體見表1。模型組心肌細胞胞核內Nrf2蛋白表達較假手術組升高。Nanoceria預處理組心肌細胞胞核內Nrf2蛋白表達均較模型組升高，其中Nanoceria預處理2組表達水平最高。

表1　大鼠心肌組織內Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA及胞核內Nrf2蛋白的表達

*：與假手術組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與Nanoceria預處理2組比較，P<0.05

3　討論

隨著冠狀動脈溶栓術、經皮冠脈支架植入術、冠狀動脈搭橋術及心臟移植手術等的廣泛開展,IR損傷成為影響治療效果的重要因素之一。鈣超載、氧自由基、細胞凋亡、心肌能量代謝障礙等均參與了IR損傷過程，導致臨床并發癥的增加。Nanoceria作為一種新型納米材料，具有粒徑相對較小而比表面積較大的特點，其表面有較多的氧空位[3-4]，這使其更容易參加氧化還原過程，從而具有一定的再生自由基清除潛力[5-6]。有研究[7-9]結果顯示，Nanoceria能直接清除O2、HO等自由基，使細胞免于脂質過氧化反應和自由基反應引起的損傷，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用。本課題組前期研究[2]已證實，對于IR損傷大鼠，Nanoceria預處理可提高其心肌組織中超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛含量，減輕IR中的氧化應激損傷，有心肌保護作用，但其通過何種機制發揮這一作用尚待進一步研究。

Nrf2是調控氧化應激表達的重要基因，可與抗氧化基因上游啟動子區的抗氧化反應元件相結合，誘導一系列內源性的抗氧化蛋白、抗氧化酶、抗炎等細胞保護基因表達上調，如調控醌氧化還原酶、血紅素氧化酶等的表達，維持細胞的氧化抗氧化平衡狀態[10-11]。本研究結果顯示，Nanoceria預處理能上調大鼠再灌注心肌中Nrf2表達量，使其下游相關細胞保護性基因NQO1、HO-1表達明顯增加，減輕再灌注心肌的氧化損傷，從而發揮保護心肌的作用。

在正常生理狀態下，Nrf2主要表達于細胞質，而當發生氧化應激或受到其他因素誘導后，Nrf2可通過磷酸化與Kelch相關蛋白1解偶聯而進入胞核內，激活依賴Nrf2的基因轉錄信號通路。本研究結果顯示，經IR應激誘導后，心肌細胞胞核內Nrf2蛋白表達水平明顯上升。Nanoceria預處理組Nrf2蛋白表達較模型組明顯上升。這說明Nanoceria預處理可增加Nrf2蛋白的表達水平，促使其核內轉移。

綜上所述，在大鼠IR損傷中，Nanoceria可作為一種新型的Nrf2誘導物激活Nrf2信號通路，使Nrf2蛋白和相關基因HO-1、NQO1表達升高，并發生Nrf2核內轉移，從而達到保護IR損傷心肌的目的。

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