人腦膠質瘤組織中HMGB1、TLR4的表達

楊如意,趙普學,許自強,安　全,李俊武,王新軍

1)鄭州大學第五附屬醫(yī)院伽瑪刀治療中心；河南省伽瑪刀治療中心 鄭州 450052　2)鄭州大學第五附屬醫(yī)院神經外科 鄭州 450052

膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，占中樞神經系統(tǒng)腫瘤的40%～50%。世界衛(wèi)生組織將膠質瘤分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級，其對膠質瘤的臨床治療及預后意義重大，而膠質瘤的發(fā)病機制目前尚未完全明確。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)是最早由Ellerman等[1]從小牛胸腺中分離得到的一種染色質非組蛋白核蛋白，幾乎存在于所有真核細胞內。研究表明，HMGB1高表達與多種疾病密切相關，如哮喘患者氣道炎癥[2]、胃癌[3]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡性疹[4]、癲癇[5]；另有研究表明，HMGB1與膀胱癌[6]、肝癌[7]患者預后密切相關。以往較少見到HMGB1及其受體Toll樣受體4(Toll like receptor-4, TLR4)與膠質瘤發(fā)病機制、腫瘤病理等方面的研究，本研究致力于探討膠質瘤患者腫瘤組織中HMGB1及其受體TLR4的表達水平與患者腫瘤病理、臨床各因素的相關性，進一步揭示HMGB1-TLR4通路在膠質瘤發(fā)病、病理中的作用。

1　對象與方法

1.1研究對象選取2015年1月1日至2017年1月1日于鄭州大學第五附屬醫(yī)院神經外科行“膠質瘤切除術”的膠質瘤患者87例為試驗組，其中男44例，女43例；中位年齡44(22～76)歲，其中≤44歲43例，>44歲44例；膠質瘤位于額葉43例，顳葉25例，枕葉19例；病理類型為星形膠質細胞瘤35例，少突星形細胞瘤30例，膠質母細胞瘤22例；低級別膠質瘤(low grade glioma,LGG)40例，高級別膠質瘤(high grade glioma，HGG)47例。納入標準：①患者術前頭顱增強MRI及MRS提示膠質瘤，術后病理確診為膠質瘤。②所有患者均為首次手術治療，無膠質瘤復發(fā)二次手術患者。③患者術前未行放化療。選取同期于該院行“顱內減壓術”患者20例為對照組，其中男12例，女8例；中位年齡41(17～65)歲。納入標準：①患者為高血壓腦出血需行“顱內減壓術”。②術中確認可留取非功能區(qū)正常腦組織。研究中獲取組織標本及臨床信息前均已獲患者、家屬知情同意。

1.2標本采集試驗組：術中切除爛魚肉樣腫瘤組織后，取足夠病理檢測標本前提下，取直徑約1 cm的腦組織標本塊3份。對照組：術中留取直徑約1 cm的非功能區(qū)正常腦組織標本塊3份。所有標本保存于凍存管內液氮凍存，轉移至-80 ℃冰箱中保存，以備檢測。

1.3腫瘤組織中HMGB1及TLR4的免疫組化檢測標本包埋完畢以3 μm厚切片，切片置于防脫劑預處理后的載玻片上。分別滴加HMGB1、TLR4單克隆抗體于4 ℃環(huán)境下過夜，PBS清洗后滴加標記二抗羊抗兔IgG，室溫下孵育20 min。PBS清洗后加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，室溫下孵育15 min。DAB顯色劑顯色并沖洗，蘇木精復染后常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片于顯微鏡下觀察。PBS液代替一抗染色作為陰性對照。HMGB1及TLR4的表達依據細胞質免疫組化染色率及染色程度綜合評分[6-7]。選擇每張切片免疫反應較強的區(qū)域，200倍視野下觀察5個不重復視野，分別計數HMGB1、TLR4染色細胞及視野內總細胞數，染色率=(染色細胞數/總細胞數)×100%。無染色細胞為0分，染色率<25%為1分，25%～為2分，50%～為3分，75～%為4分；染色程度依據細胞質染色深度進行評分：無染色為0分，淡褐色為1分，深褐色為2分。取2種評分之和為最終得分：0分，陰性(-)；1～6分，陽性，其中1～3分為低表達(+)，4～6分為高表達()。

1.4腫瘤組織中HMGB1及TLR4的Westernblot檢測取冰凍組織300 mg，剪碎并置于勻漿器中進行蛋白裂解，冰上勻漿，充分裂解組織標本中HMGB1和TLR4，嚴格按試劑盒操作步驟進行檢測，采用凝膠成像分析系統(tǒng)測定各條帶的吸光度值，以此代表相對表達量。實驗重復3次。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學處理。試驗組與對照組腦組織中HMGB1、TLR4陽性表達率的比較采用校正χ2檢驗或Fisher確切概率法；試驗組患者膠質瘤組織中HMGB1、TLR4表達水平與臨床因素的關系采用χ2檢驗進行分析；利用列聯(lián)系數分析試驗組膠質瘤組織中HMGB1與TLR4表達的關聯(lián)性；采用兩獨立樣本的t檢驗分析不同病理級別腫瘤組織中HMGB1、TLR4表達水平的差異。檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.12組腦組織中HMGB1、TLR4表達的比較試驗組患者膠質瘤組織中HMGB1、TLR4陽性表達率均高于對照組(表1、圖1)。

表1　2組腦組織中HMGB1、TLR4表達情況的比較　例

*：確切概率法;#:校正χ2檢驗

A：HMGB1陰性表達；B：HGMB1低表達；C：HGMB1高表達；D：TLR4陰性表達；E：TLR4低表達；F：TLR4高表達圖1　腦組織中HMGB1、TLR4免疫組化染色結果(SP，×200)

2.2試驗組腫瘤組織中HMGB1、TLR4表達水平與臨床因素的關系試驗組患者膠質瘤組織中HMGB1及其受體TLR4表達水平與膠質瘤病理級別有關，而與患者性別、年齡、膠質瘤位置、膠質瘤病理類型無關(表2)。

表2　試驗組患者膠質瘤組織中HMGB1、TLR4表達水平與臨床因素的關系　例

2.3試驗組膠質瘤組織中HMGB1與TLR4表達水平的關聯(lián)性試驗組患者膠質瘤組織中HMGB1表達水平與TLR4表達水平呈正相關(表3)。

2.4試驗組不同病理級別腫瘤組織中HMGB1、TLR4的Westernblot檢測結果比較結果見圖2、表4。HMGB1及其受體TLR4在HGG組織中表達水平均較LGG組織高。

表3　試驗組膠質瘤組織中HMGB1與TLR4表達水平的關聯(lián)性分析　例

χ2=29.964,rp=0.515,P<0.001

圖2　不同病理級別膠質瘤組織中HMGB1、TLR4的表達

表4　不同病理級別膠質瘤組織中HMGB1、TLR4表達水平的比較

3　討論

HMGB1作為一種染色體結合蛋白，在機體內既可充當染色體的結構蛋白，又可作為一種細胞因子。研究[8-10]表明，HMGB1可在腫瘤細胞的細胞核中高表達，同時也可通過炎癥反應被釋放至細胞外。腫瘤在缺氧、營養(yǎng)缺乏或生長必需營養(yǎng)因子缺乏而壞死時，或者在抗腫瘤藥物所致的腫瘤細胞壞死時均有HMGB1被釋放至細胞外的情況。

HMGB1可與多種因子，如P53[11]、P73[12]以及NF-κB家族因子[13]、雌激素受體[14]共同作用促進腫瘤細胞的復制與腫瘤的發(fā)展。細胞外的HMGB1可與其受體TLR4或RAGE結合，激活細胞外重要的細胞通路，如MAPK、NF-κB[15-16]通路，以誘發(fā)腫瘤細胞的生長、侵襲、轉移。研究[17]表明，通過抑制HMGB1受體RAGE的表達可明顯抑制結直腸癌的復發(fā)。HMGB1通過TLR家族受體參與免疫反應，TLR家族受體幾乎存在于所有的免疫抑制細胞內。研究[18]表明腫瘤細胞產生的HMGB1可促進T細胞產生IL-10，從而抑制機體免疫功能。這些發(fā)現(xiàn)均表明，HMGB1及其受體在腫瘤的免疫抑制中發(fā)揮了重要作用，促使腫瘤的侵襲和轉移。

HMGB1及其受體TLR4、RAGE在各系統(tǒng)腫瘤中的研究均有報道，目前尚鮮見神經系統(tǒng)腫瘤如膠質瘤的發(fā)病、病理、治療、預后與HMGB1及其受體關系的研究。本研究通過檢測HMGB1及其受體TLR4在膠質瘤患者腫瘤組織中的表達，分析其與患者臨床病理因素的關系，探討其臨床意義。膠質瘤患者腫瘤組織中HMGB1、TLR4的表達均與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤病理類型無關，而與患者的病理級別密切相關。膠質瘤患者預后與膠質瘤病理級別關系密切已為神經外科醫(yī)師公認。膠質瘤患者腫瘤組織中HMGB1、TLR4均與患者病理級別密切相關，表明HMGB1及其受體TLR4可能直接參與膠質瘤的發(fā)病，其發(fā)病機制是否與HMGB1-TLRs參與腫瘤免疫反應有關，尚需進一步研究闡明。此外，本研究結果還顯示，膠質瘤組織中HMGB1與其受體TLR4的表達水平呈正相關，進一步表明HMGB1-TLR4形成通路在膠質瘤的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

目前的研究為膠質瘤病理級別與膠質瘤組織中HMGB1-TLR4的相關性研究，仍需大量研究以闡明HMGB1-TLR4通路在膠質瘤發(fā)病中的機制，后期將著力于HMGB1-TLR4與膠質瘤患者預后之間的研究，并發(fā)掘HMGB1-TLR4通路的臨床應用價值。

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