6種酵母發酵菠蘿酒香氣成分的GC-MS分析及其篩選

龐惟俏，曲鵬宇，魏程程，郭德軍

(1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319； 2.欽州學院食品工程學院，廣西欽州 535000)

菠蘿（Ananas comosus（Linn.）Merr.），又名鳳梨，含有豐富的糖類、蛋白質和維生素等，同時菠蘿還具有清熱解暑、生津止渴，改善消化不良、小便不利等藥用價值[2]。由于菠蘿香氣濃郁、出汁量高，在微生物的作用下適合進行發酵釀酒，不但可使菠蘿的營養成分充分溶出，也可發揮其藥用功效[3]。目前，我國菠蘿種植面積較大，收獲期價格低廉，但市售的菠蘿飲品的種類相對較少，如菠蘿果汁、菠蘿啤酒，而菠蘿發酵酒卻很少見。因此，開發香氣濃郁的菠蘿酒是十分有必要的。

在果酒的釀造中，發酵菌種直接影響菠蘿酒的品質、酒精度、香氣和發酵速度[4]。根據已報道文獻，對篩選菠蘿酒釀酒酵母的研究相對較少，都集中研究其發酵工藝和其揮發性成分。陳文學等[5]優化菠蘿酒的發酵工藝，當工藝參數為添加糖219.8 g/L，調pH3.5，發酵溫度為19.8℃時，菠蘿酒的口感最佳。孔慧娟等[6]采用GC-MS對菠蘿鍵合態香氣成分進行分析和鑒定，確定醇和酚對其香氣成分貢獻較大。因此，本實驗以菠蘿為原料，使用6種不同的工業化釀酒酵母菌株進行發酵釀制菠蘿酒，并采用頂空固相微萃取法和氣相色譜-質譜聯用技術，對其揮發性香氣成分進行定性定量分析，明確其發酵香氣；通過測定其酒精度、總酸等理化指標，并結合感官評價結果，篩選釀造菠蘿酒的最佳釀酒酵母，為更好地釀造色澤鮮亮，果香味濃郁，口味協調，酒體穩定的菠蘿酒提供參考依據。

1　材料與方法

1.1　材料、試劑及儀器

菠蘿，購自大慶九區批發市場；果酒干酵母RC212、AC、71B、2323、EVYRED、K1、酒明串珠菌，購自煙臺帝伯仕自釀機械有限公司。

試劑：果膠酶、對甲氧基苯甲醛、亞硫酸（分析純），上海生工生物工程股份公司。

儀器設備：7890A氣相色譜儀、5975質譜儀，Agilent公司；色譜柱：DB-5(60m×0.25mm×0.25μm)，固相微萃取裝置，PDMS/DVB 50/30μm萃取頭，J&W Sci.公司。DK-8D電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司；722S可見光分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；TD25-WS多管架自加平衡離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1　菠蘿酒的制備

菠蘿酒釀造工藝見圖1，其操作要點如下。

圖1　菠蘿酒制備工藝流程圖

（1）制備菠蘿酒：挑選成熟度高的菠蘿作為原料，削皮，榨汁。添加質量分數為0.03%的果膠酶，以提高菠蘿的出汁率，50℃恒溫水浴2 h。添加蔗糖，其中菠蘿汁發酵的總糖度應控制在24%～25%，分3次加入；添加0.03%的硫酸銨，以補充氮源；添加200 mg/L亞硫酸，抑制雜菌繁殖和護色[7-8]。

（2）活化酵母：分別取6種干酵母1 g，35℃條件下置于20 mL質量分數2%蔗糖溶液中并攪拌15 min，30℃恒溫靜置1.5 h活化后即可使用[9]。

（3）主發酵：將活化后的酵母菌液按質量分數5%接種于菠蘿果汁中，25℃恒溫發酵14 d。

（4）降酸：由于菠蘿酸度過高，使得菠蘿酒口感酸澀，因此添加酒明串珠菌(1 g/200 L)促進蘋果酸乳酸發酵，20℃恒溫發酵28 d，以降低其酸度。

1.2.2　菠蘿果汁及酒揮發性成分分析

取約10 mL樣品加入40 mL樣品瓶中，加入濃度為1.121 μg/mL對甲氧基苯甲醛內標溶液0.1 μL，將樣品瓶放入60℃的水浴中平衡10 min，將老化好的萃取針頭插入樣品瓶中，將石英纖維頭暴露于樣品瓶的頂空氣體中，恒溫60℃萃取40 min，用手柄將纖維頭推回針頭內拔出，插入GC-MS的進樣器于250℃條件下解析1 min，同時啟動儀器采集數據。

（1）色譜條件。參照楊華等[10]的研究，將色譜條件設為進樣口溫度250℃，載氣He，流速1.0 mL/min。采用程序升溫方式，由室溫升至80℃保持5 min，然后以4℃/min升至240℃,在此溫度下保持2 min，選擇不分流進樣。

（2）質譜條件。MS離子源在225℃全掃描，電離方式：EI，電子能量70 eV；掃描質量范圍：50～500 amu。

1.2.3　定性定量分析菠蘿酒

（1）定性分析。利用計算機對采集到的質譜圖進行檢索，輔助人工解析圖譜，與NIST 02.L標準譜庫進行對照匹配。

（2）定量分析。根據對甲氧基苯甲醛內標物的濃度，按下面公式計算出菠蘿酒中每種揮發性組分的含量。

式中：X—菠蘿酒中揮發性成分的濃度，ng/mL；

A0—內標物對甲氧基苯甲醛的峰面積；

Ai—揮發性成分的峰面積；

m—內標物對甲氧基苯甲醛的質量，μg；

V—處理前樣品的體積，mL。

1.2.4　菠蘿酒感官評定

參照《葡萄酒工業手冊》及GB/T 15038—2006，選取10名實驗室有經驗的品評成員（男女各5人）對菠蘿酒進行感官評定，從色澤、香氣、口味、風格4個方面進行評分。具體感官評分指標見表1[5，7]。

2　結果與分析

2.1　主要香氣成分分析

對菠蘿酒的揮發性成分的研究有助于解釋其酒體香氣及味道。不同酵母發酵的菠蘿果汁及酒的主要香氣成分分析結果見表2。由表2可知，采用HS-SPME和GC-MS技術，在6種不同酵母發酵的菠蘿酒中共檢出60種揮發性成分，主要包括酯類27種、醇類8種、酸類6種、酚類5種、烷烴類2種、酮和醛類5種、其他類7種。而在菠蘿果汁中僅鑒定出8種香氣成分，與菠蘿酒相比較，未檢出醇類、酚類和烷烴類；菠蘿果汁的揮發性成分相對單一，僅有少數的3種酯、1種酸、3種酮醛、1種其他化合物。

表1　菠蘿酒感官評定標準

表2　不同酵母發酵的菠蘿果汁及酒的主要香氣成分

續表2　不同酵母發酵的菠蘿果汁及酒的主要香氣成分

菠蘿果汁經酵母發酵，其揮發性成分的種類和含量明顯增多。在71B酵母釀造的菠蘿酒中，共檢測出21種香氣成分，揮發性成分總含量為769.73 ng/mL，其主要揮發性成分為乙酸乙酯（45.48 ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-環氧丁烷（515.01ng/mL）、苯乙醇（43.17ng/mL）、辛酸（45.48 ng/mL）。在2323酵母釀造的菠蘿酒中，揮發性成分比71B多4種，揮發性成分總含量為473.87 ng/mL，主要香氣成分為3,3-二甲基-1,2-環氧丁烷（138.367 ng/mL）、苯乙醇（66.90 ng/mL）、辛酸（41.91ng/mL）、甲苯-2,4-二異氰酸酯（120.55ng/mL）、酞酸二乙酯（25.06 ng/mL）。在AC酵母釀造的菠蘿酒中揮發性成分最多，為29種，總含量為561.86 ng/mL。包括甲酸異戊酯（74.64ng/mL）、苯乙醇（68.63ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-環氧丁烷（209.95 ng/mL）、4-羥基-2-丁酮（30.49 ng/mL）等主要成分。28種揮發性成分在EVYRED酵母釀造的菠蘿酒中被檢出，總含量為502.00 ng/mL，主要香氣成分為1-戊醇（26.71 ng/mL）、異戊醇（24.15 ng/mL）、苯乙醇（82.04 ng/mL）、辛酸（24.01 ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-環氧丁烷（219.91 ng/mL）。K1酵母釀造的菠蘿酒的總揮發性成分含量為571.39 ng/mL，包含24種揮發性成分，主要香氣成分為乙酸乙酯（26.73 ng/mL）、異戊醇（82.22 ng/mL）、苯乙醇（79.28 ng/mL）、辛酸（22.16 ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-環氧丁烷（266.53ng/mL）。RC212酵母釀造的菠蘿酒中被檢出的揮發性成分種類最少，僅有16種，總含量為763.41ng/mL，主要香氣成分為乙酸乙酯（44.70ng/mL）、苯乙醇（84.25 ng/mL）、己酸（20.55 ng/mL）、辛酸（36.84 ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-環氧丁烷（510.08ng/mL）。

2.2　不同酵母發酵的菠蘿酒揮發性成分的比較分析

2.2.1　酯類成分的比較分析

酯類物質是發酵酒揮發性成分的重要組成部分，也是構成其香氣骨架的重要成分。分別經6種酵母發酵的菠蘿酒中，酯類化合物的種類和含量較菠蘿原液均明顯增加，賦予其明顯的發酵香氣；酵母菌2323菌株發酵的菠蘿酒中酯含量最高，為176.32 ng/mL，是原液含量的10倍；EVYRED菌株發酵的酯含量最低，為76.51 ng/mL，這表明不同酵母菌株發酵所能產生的酯類含量差異性較大。乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、甲苯-2,4-二異氰酸酯、十四酸乙酯是6種菠蘿酒的共有酯類物質，且經酵母發酵后含量大量增加，這是因為酵母能促進酯化反應的產生[11]。酞酸二乙酯僅在2323菌株的發酵酒中被檢出，含量為25.06 ng/mL，具有芳香氣味，目前，未見在菠蘿酒中檢出的報道。經6種酵母發酵后的菠蘿酒中增加的酯類還包括乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等，這些化合物可增加酒體的整體香氣并豐富香氣的復雜性，具有輔助增香作用[12]。

2.2.2　醇類成分的比較分析

酵母代謝菠蘿原液中的糖類物質，轉化成醇類化合物[13]。除乙醇外，菠蘿汁分別經6種酵母發酵后產生的醇類主要包括1-戊醇、異戊醇、苯乙醇，每種醇的含量均大于10 ng/mL。6種菠蘿酒中共有的醇類成分只有苯乙醇，同時含量也較高，苯乙醇具有清甜的玫瑰花香和水果香氣[14]，符合中國人的口味偏好；酵母RC212釀造的菠蘿酒中苯乙醇含量最高，為84.25 ng/mL。孔慧娟[6]在菠蘿酒中檢出50 ng/mL的苯乙醇，并證實其給人柔和的愉悅感。K1酵母發酵的菠蘿酒中異戊醇含量較高，為82.22 ng/mL，但異戊醇有令人不悅的苦杏仁味道，影響其口感[15]，除EVYRED和K1菌株以外的其他酵母釀造的菠蘿酒中未檢出該物質。

2.2.3　酸類、酚類成分的比較分析

有機酸是保持果酒中酒體平衡和口感清爽特性的主要物質[16]。菠蘿酒中的酸類物質使得其略帶酸味，主要是糖的丁酸發酵和蛋白質氧化時的產物。6種菠蘿酒中共有的酸類香氣成分有辛酸和己酸，且含量也較多；它增加了菠蘿酒的柔和口感，但原液中未檢出，這兩種酸應該是釀酒酵母的代謝產物；其中，71B酵母釀制的菠蘿酒中辛酸含量最高，為45.48 ng/mL。在菠蘿果汁中檢出3.31 ng/mL肉桂酸，但在所有菠蘿酒中未檢出肉桂酸，這可能是因為酒明串珠菌將該酸轉化為醇，使得含量減少[17]。4.76 ng/mL的棕櫚酸在酵母EVYRED菌株發酵的菠蘿酒中檢出，張慶慶[13]在紅曲菠蘿酒中也檢出少量棕櫚酸；導致其含量較低的原因可能是其與醇發生酯化反應生成棕櫚酸乙酯。菠蘿果汁中未檢出酚類物質，但4-乙烯基-2-甲氧基苯酚在所有果酒中被檢出，呈強烈丁香和發酵似香氣，有炒花生氣息。71B酵母發酵的酒中該化合物的含量較多，為17.94 ng/mL，該酚是酵母菌代謝產生的次級產物。6種果酒中其他酚類化合物含量相對較少，但其與醇、酸和酯共同組成菠蘿酒圓潤的香氣。2.2.4醛酮類成分的比較分析

6種菠蘿酒中的醛酮類香氣成分的種類和含量較少，在菠蘿果汁及果酒中未發現共同的羰基化合物。AC釀造的菠蘿酒中，4-羥基-2-丁酮含量最高，為30.49 ng/mL，其可賦予菠蘿酒芳香氣味。1.79 ng/mL的2-羥基-4-甲基苯甲醛和11.18 ng/mL的3-辛酮僅在菠蘿汁中被檢出，這可能是因為該化合物被酵母利用轉化成醇類化合物。對比已發表文獻，在菠蘿酒中檢出的醛酮化合物含量均不高，但其與其他種類的化合物相互作用，有助于菠蘿酒的增香[18]。

2.2.5　其他類成分的比較分析

其他類化合物盡管種類和含量較少，但對菠蘿酒的香氣構成也有貢獻作用。菠蘿酒中檢測到的其他類揮發性成分共7種，主要存在于71B、2323、AC、EVYRED酵母菌株釀造的菠蘿酒當中，含量最多的為酵母AC釀造的菠蘿酒，為17.65 ng/mL。3,4-環氧四氫呋喃只在菠蘿汁中被發現，符楨華[19]在菠蘿發酵的果醋中也檢出該呋喃化合物，并證實其是菠蘿醋的典型風味成分。

表3　不同酵母發酵的菠蘿酒的感官評價結果及理化指標

2.3　菠蘿酒的理化性質和感官評定結果

通過對不同菌株發酵的菠蘿酒的理化指標和感官評價進行測定，結果見表3。感官評分排名為2323＞EVYRED＞71B＞RC212＞AC＞K1。2323和EVYRED酵母的產酒能力強，殘糖低，酸度較低，感官評價綜合評分比較高，且風格和口味較佳，適合用于釀造菠蘿酒；71B酵母產酒能力強，酸度較低，但是風味、口感皆不佳，感官評定總分低；RC212、K1、AC酵母釀制的菠蘿酒香氣較佳，但酒口感酸，綜合評分較低，不太受品鑒者歡迎。

不同酵母菌株發酵對菠蘿酒風味的影響較大，其主要的影響來源于揮發性成分的差異。賈言言也報道梅奇酵母屬的M.agaves可用于菠蘿酒的釀造，并可獲得豐滿的酒體[11]。

3　結論

GC-MS分析表明，菠蘿汁經發酵后，其揮發性化合物的種類和含量明顯增加，這與酵母的酶活和代謝中間產物種類關系較大。在菠蘿發酵酒中檢出60種揮發性成分，而在菠蘿汁中共有8種揮發性成分被檢出，增加了52種揮發性成分，其中兩者共有的主要成分有8種。不同酵母發酵的菠蘿酒香氣具有明顯的差異性，主要的揮發性香氣成分是酯類、醇類、酸類、酚類和醛酮類僅占少部分，這預示著酵母菌株是影響菠蘿酒發酵品質的一個重要因素。同時，GC-MS分析結果也佐證了理化指標和感官評定結果，酒的酯香可能是中國人偏愛的一個重要的香氣取向；側重感官評定，故選取2323酵母菌株為釀造菠蘿酒的最優菌種。由于菠蘿果汁及菠蘿酒中的各種揮發性香氣成分的含量、種類、感官閾值以及相互作用決定其最終的香氣特征，所以菠蘿果酒中的某些特征組分的相互作用和發酵控制還需進一步地探索與驗證。

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