MED19基因靶向RNA干擾重組慢病毒對體內胃癌細胞的增殖抑制作用△

丁相福，王婷婷，王輝，袁偉杰，徐廣甍

吉林大學第二醫院1甲狀腺外科，2血液科，4結直腸外科，長春130041 3長春市南關區醫院綜合外科，長春1300410

胃癌在早期可以發生轉移，進展期胃癌的手術切除率低，放化療的不良反應大，5年生存率約為30%，尋找一種新的治療方案成為目前胃癌研究的一個重要的課題。近年來，隨著胃癌的分子生物學研究進展，人們認識到胃癌的發生主要與癌基因的突變、擴增、過度表達以及抑癌基因的突變、失活等密切相關；因此，在基因水平治療胃癌是未來的發展方向。

MED19是2003年克隆的新基因，位于染色體的11q12.1位置，編碼一種與酵母中促進轉錄的Mediator 19（MED19）同源蛋白，是中介因子復合體的亞基。MED19在酵母菌的曾用名為ROX3、SSN7和RMR1等。MED19的人類同源基因為肺癌轉移相關基因LCMR1[1]。目前，MED19基因在很多腫瘤組織中被發現，如肺癌、胃癌、大腸癌和膀胱癌等。研究發現，MED19基因與胃癌的細胞分化程度、淋巴結轉移情況和TNM分期有關[2]。本研究通過MED19基因靶向RNA干擾重組慢病毒對體內胃癌細胞的干預，觀察其治療效果，希望MED19基因成為一個新的腫瘤治療靶向因子。

1 材料與方法

1.1 材料

SGC7901胃癌細胞株，由中科院上海生化細胞所提供。

36只BALB/C‐nu/nu裸鼠，購于上海吉凱基因化學技術有限公司，性別、鼠齡及體重間差異均無統計學意義，飼養于吉林大學基礎醫學部SPF級屏障動物實驗室[SYXK（吉）2007‐0011]，喂養環境、溫度和條件均符合實驗要求。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗用細胞懸液的制備SGC7901胃癌細胞株，經復蘇和傳代后置入培養瓶中備用。將細胞株分3組：①正常培養的SGC7901胃癌細胞，不用病毒顆粒轉染，作為空白對照，以BC標記，為BC組；②用shRNA慢病毒顆粒感染，呈陰性，作為陰性對照，以NC標記，為NC組；③用MED19基因的shRNA慢病毒感染，呈陽性，作為病毒干擾，以VⅠ標記，為VⅠ組（MED19基因的shRNA慢病毒載體購于上海吉凱基因科技有限公司）。經胰酶消化后，制成細胞懸液，接種于細胞培養瓶中，根據感染復數（multiplicity of infection，MOⅠ）=10，分別向NC組和VⅠ組加入LV-NC和LV-MED19基因的shRNA慢病毒顆粒，同時設經胰酶消化后的空白對照，以CON標記，繼續培養。感染72 h后觀察慢病毒感染率，以50%為界限，若感染率≥50%，繼續培養；若＜50%，需要重新進行感染實驗。感染5 d后，各組細胞的感染率均＞90%，滿足實驗需要。培養期間，細胞正常傳代。細胞活力≥95%，采用臺盼藍拒染法，將細胞離心2 min，在1000 r/min的條件下將培養基棄除。將無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered so‐lution，PBS）溶液加入細胞內，調整細胞濃度至2.5×107/ml，制備成動物實驗需要的細胞懸液。將懸液加入1.5 ml的EP管中，置于4℃冰上待用。

1.2.2 人胃癌裸鼠皮下種植瘤模型的建立36只裸鼠經專業人員飼養1周以上，隨機分為3組，每組12只。3組分別以BC、NC和VⅠ標記，分別接種BC、NC、VⅠ3組細胞。建立模型的過程如下：按照組別將各組裸鼠分別移至超凈臺，用碘伏消毒待接種的部位，混勻細胞懸液。選擇裸鼠右側腋下皮下為接種部位，抽取0.2 ml細胞懸液接種，形成約3 mm皮丘，注射后局部壓迫片刻。觀察成瘤情況，每日觀察內容：瘤體生長情況、是否感染、出瘤時間及腫瘤是否自然消退。腫瘤直徑≥3 mm為成瘤標準。成瘤體積（mm3）=腫瘤長徑（mm）×腫瘤橫徑（mm）×腫瘤橫徑（mm）/2，取平均值。成瘤35 d后，采用脫頸法將全部裸鼠處死，沿包膜完整分離瘤體，用分析天平精確稱取腫瘤的質量，將腫瘤以10%甲醛固定，石蠟切片，蘇木精‐伊紅（hematoxy‐lin‐eosin，HE）染色。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件分析數據，計數-資料以率（%）表示，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK‐q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠皮下接種腫瘤細胞后的生長情況

裸鼠皮下接種腫瘤細胞后，各組瘤體生長狀態均良好。接種后，BC組和NC組裸鼠的中位成瘤時間約為7 d，VⅠ組裸鼠的中位成瘤時間約為9 d。

成瘤的標準為接種部位皮下出現小結節。BC組和NC組裸鼠全部長出腫瘤，成瘤率為100%；VⅠ組10只裸鼠長出腫瘤，成瘤率為83.3%。全部裸鼠的總成瘤率為94.4%。

2.2 裸鼠皮下接種腫瘤的體積變化

隨著飼養時間的延長，全部裸鼠的腫瘤體積逐漸增大，未出現自發消退現象。每7天測量1次腫瘤體積并記錄。接種21 d后，BC組和NC組裸鼠的成瘤體積明顯大于VⅠ組。隨著飼養時間的延長，VⅠ組裸鼠的腫瘤生長速度明顯低于BC組和NC組，詳見圖1。

圖1 腫瘤的生長曲線

2.3 瘤體的鏡下觀察結果

對3組瘤體行常規HE染色，在光鏡下觀察可以確認腫瘤的病理類型為低分化胃腺癌，VⅠ組癌組織在光鏡下（×400）可以明顯觀察到細胞的形態學變化，表現為細胞縮小、皺縮及細胞呈現片狀壞死等征象；而BC組和NC組癌組織在光鏡下不顯示或很少顯示上述變化。（圖2）

圖2 各組離體瘤組織（HE染色，×400）

3 討論

MED19是2003年克隆的新基因，人類同源基因為肺癌轉移相關基因LCMR1[1]，已在很多腫瘤組織中被發現，如肺癌、胃癌、大腸癌和膀胱癌等。作為中介體的亞單位MED19（Rox3），最初在研究CYC7基因突變體中被發現，其無論是在轉錄激活還是轉錄抑制中均發揮了重要的作用。近年來，針對MED19基因的研究不斷增加，其功能不斷被揭示出來。相關研究表明，MED19基因的功能如下：①MED19基因突變可以抑制Gal4和Gcn4誘導的基因活化[3‐4]，引起一系列的效應，如熱休克、葡萄糖抑制效應和HO基因的阻遏作用消失[5‐7]；②MED19基因的剔除或缺失，可以引起一系列的基因表達量上升或下降[8]；③在中介體復合物各部分的內在相互作用中，MED19起著十分重要的調控作用[9]；④在RE1沉默轉錄因子誘導的神經基因表觀沉默過程中，MED19/MED26在中介體復合物中發揮了重要的促進作用[10]；⑤在基因轉錄過程中，中介體MED19發揮著重要的作用，其與細胞的生長及周期調控有密切的關系。本研究在胃癌SGC‐7901細胞體外實驗的基礎上，分析了MED19基因在體內的相關功能和機制。

目前，胃癌是世界上公認的最常見的惡性腫瘤之一，中國被認為是胃癌的高發地區。癌癥的發生與諸多因素有關，其中癌基因的非正常活化、抑癌基因的非正常失活與癌癥的發生有密切的關系。如果可以找到所需要的沉默癌基因表達的小片段序列，通過RNAi技術，可能使其成為抑制胃癌的新靶點。在本研究的前期工作中[11]，成功地獲得了有效的MED19‐shRNA包裝病毒，在體外實驗中成功感染SGC7901細胞后，其mRNA和蛋白表達水平下降，獲得了預期結果，這證明可以利用RNAi沉默MED19基因且效果良好。體外實驗結果對下一步研究有一定的指導意義，如果可以觀察到體內RNAi沉默MED19基因的效果，對是否可以找到胃癌治療的新靶點非常重要，是進行更深一步研究的基礎；如果可以證明RNAi靶向沉默MED19基因后，瘤體的生長速度和侵襲度明顯下降，可以大膽地假設針對MED19基因進行干預可以為胃癌治療提供一個新的靶點。本研究基于體外實驗，利用裸鼠成功構建胃癌體內模型，通過分析結果可以發現，VⅠ組裸鼠的出瘤時間明顯長于BC組和NC組，而出瘤后比較相同時間內各組裸鼠腫瘤的生長情況，可以發現VⅠ組腫瘤體積小于BC組和NC組。這個結果與正在進行的體外實驗所觀察到的沉默MED19的表達后腫瘤的生長、增殖有明顯的抑制一致，說明MED19基因靶向RNA干擾重組慢病毒對體內胃癌細胞的增殖有明顯的抑制作用，揭示了MED19基因沉默后可以明顯地影響胃癌SGC7901細胞的增殖和細胞周期，這些為后續研究MED19基因在癌癥中的作用機制和臨床研究打下了基礎。

[1]Samuelsen CO,Baraznenok V,Khorosjutina O,et al.TRAP 230/ARC 240 and TaRAP 240/ARC 250Mediator subunits are functionally conserved through evolution[J].Pro Nati Acad Sci U S A,2003,100(11):6422‐6427.

[2]丁相福,黃國民,李俊安,等.Med19在人胃癌中的表達及其臨床意義[J].中國老年學雜志,2010,30(9):1196‐1197.

[3]Brown TA,Evangelista C,Trumpower BL.Regulation of nuclear genes encoding mitochondrial proteins in saccharo‐myces cerevisiae[J].J Bacteriol,1995,177(23):6836‐6843.

[4]Qiu H,HU C,Yoon S,et al.An array of coactivators is re‐quired for optimal recruitment of TATA binding protein and RNA polymeraseⅡ by promoter‐bound Gcn4p[J].Mol Cell Biol,2004,24(10):4104‐4117.

[5]Singh H1,Erkine AM,Kremer SB,et al.A functional mod‐ule of yeast mediator that governs thedynamic range of heat shock gene expression[J].Genetics,2006,172(4):2169‐2184.

[6]Song W,Treich Ⅰ,Qian N,et al.SSN genes that affect tran‐scrip tional repression in Saccharomyces cerevisiae encode SⅠN4,ROX3,and SRB proteins associated with RNA poly‐meraseⅡ[J].Mol Cell Biol,1996,16(1):115‐120.

[7]TabtiangRK,HerskowitzⅠ.NuclearproteinsNut1pandNut2p cooperate to negatively regulate a Swi4p‐dependent lacZ re‐porter gene in Saccharomyces cerevisiae[J].Mol Cell Biol,1998,18(8):4707‐4718.

[8]van de Peppel J,Kettelarij N,van Bakel H,et al.Mediator expression profiling epistasis reveals a signal transduction pathway with antagonistic submodules and highly specific downstream targets[J].Mol Cell,2005,19(4):511‐522.

[9]Baidoobonso SM,Guidi BW,Myers LC.Med19(Rox3)reg‐ulates intermodule interactions in the saccharomyces cerevi‐siae mediator complex[J].J Biol Chem,2007,282(8):5551‐5559.

[10]Ding N,Tomomori‐Sato C,Sato S,et al.MED 19 and MED 26 are synergistic functional targets of the RE1 silencing transcription factor in epigenetic silencing of neuronal gene expression[J].JBiolChem,2009,284(5):2648‐2656.

[11]丁相福,李俊安,黃國民,等.MED19基因在胃癌SGC7901細胞中的功能研究[J].河北醫藥,2010,32(8):899‐902.