Snail轉錄因子與ER- α36介導的雌激素信號在胃癌腫瘤細胞成球作用中的研究

朱勇，朱媛，魯正學，李偉

重慶市長壽區人民醫院腫瘤科，重慶4012200

胃癌在中國是最常見的惡性腫瘤之一，并且絕大多數的胃癌患者在確診時病情已進展到中晚期，常發生腹膜、肝臟、淋巴結轉移，胃癌患者的5年生存期較短，預后較差[1]。隨著對胃癌的發生、發展、侵襲及轉移的深入研究，發現胃癌腫瘤組織內存在數量不多的惡性細胞亞群，即腫瘤干細胞。腫瘤干細胞在腫瘤形成、侵襲、轉移中的作用機制和如何靶向治療特異性腫瘤干細胞已成為目前研究的熱點[2]。目前證實了人胃癌組織中也含有腫瘤干細胞，此外，在多株體外培養的人胃癌細胞系內也得到進一步的證實，有少量具有干細胞樣特性的胃癌腫瘤干細胞的存在，并且，有關胃癌腫瘤干細胞方面的研究也取得了一定的進展[3‐4]。Snail可通過多種途徑促使上皮‐間質轉化（epithelial‐mesenchymal transition，EMT），在許多腫瘤組織中呈中高表達，被視為腫瘤侵襲轉移的促進因素。另外，異常表達的Snail不僅可以有效地介導細胞存活，并使其獲得干細胞樣特性，還可以誘導腫瘤干細胞的存在。而雌激素受體（estrogen receptor，ER）的缺失與Snail高表達相關聯，即ER‐α36介導的雌激素信號能促進SGC7901細胞的增殖與侵襲，ER‐α36介導的雌激素信號途徑可能通過Snail作用于胃癌腫瘤干細胞[5‐7]。Snail蛋白作為參與EMT過程的重要分子，其在胃癌腫瘤干細胞形成過程中的作用及機制有待進一步深入研究。

實驗細胞系：空載體轉染的人胃癌細胞系SGC7901（由復旦大學醫學院免疫學教研室饋贈），本實驗室構建的穩定高表達ER‐α36的SGC7901細胞株High36、穩定沉默ER‐α36的SGC7901細胞株Low36。

實驗試劑：胰蛋白酶購自美國Sigma公司，青霉素‐鏈霉素和谷氨酰胺購自北京碧云天生物科技有限公司，優質胎牛血清FBS購自澳洲，DMEM培養基購自Hyclone公司，無酚紅DMEM/F12購自杭州吉諾公司，EGF購自 Gali‐Bio公司，FGF購自PeproTech公司，B27購自Gibco公司，17β‐雌二醇（17β‐Estradiol，E2β）購自美國Sigma公司，糖皮質激素氫化可的松（hydrocortisone）購自美國Sigma公司，細胞裂解液RⅠPA購自北京普利萊基因技術有限公司，BSA蛋白標準品購自北京碧云天生物科技有限公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自武漢飛弈生物科技有限公司，甘油購自美國Sigma公司，蛋白MARKER購自美國Fermentas公司，0.22μmol/L PVDF膜購自美國Millipore公司，ECL化學發光檢測試劑盒購自北京碧云天生物科技有限公司，CD24、CD44抗體購自BD公司，Snail抗體購自Abcam公司，ER‐α36抗體由美國Creighton大學王兆一教授饋贈，FⅠTC‐標記山羊抗兔購自Thermo公司，hoechst33258細胞核染色劑購自北京碧云天生物科技有限公司，無水乙醇和甲醇及甲醛分析純購自國藥集團化學試劑有限公司。

1材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細胞球的培養取交替培養于含80%FBS培養瓶的SGC7901細胞，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2次后，經胰酶消化至輕輕晃動，使細胞可完全脫落，再放置1 min后，加入SSM終止消化，輕輕機械吹打數次，收集細胞，1200 rpm，離心3 min，去上清后加入無血清培養基（serum free medium，SFM）輕輕吹打數次，使細胞成單細胞培養液。取100μl的細胞懸液加900μl PBS稀釋，用全自動細胞計數器計數后重懸于SFM中，細胞以5×103/ml的密度分別接種于100 mm普通的培養皿和超低吸附培養皿中，補充SFM至總培養液體積為10 ml。放置于37℃、5%CO2、95%濕度的恒溫細胞培養箱中，培養至第4天換液。

1.2.2 腫瘤細胞球HE染色當培養皿中形成腫瘤細胞球（1周）后收集細胞球，低速離心去上清液。加入新鮮配制的4%多聚甲醛固定30 min，涂在用0.5%明膠處理好的載玻片上，自然晾干。使用蘇木素液染色（5～10 min），培養基中加入流水洗去蘇木素液（1 min）、1%鹽酸‐酒精（1～3 s）、流水沖洗（10～15 min）、蒸餾水洗（1～2 min）、0.5%伊紅液染色（1～3 min）、蒸餾水稍洗（1～2 s）、80%乙醇（1～2 s）、95%乙醇Ⅰ（2～3 min）、95%乙醇Ⅱ（2～3 min）、無水乙醇Ⅰ（3～5 min）、無水乙醇Ⅱ（3～5 min）、二甲苯Ⅰ（3～5 min）、二甲苯Ⅱ（3～5 min）、二甲苯Ⅲ（3～5 min）。使用中性樹膠封固并于倒置顯微鏡下拍照。

1.2.3 Westernblot鑒定腫瘤細胞球中Snail及相關蛋白的表達收集無血清懸浮培養1周的腫瘤細胞球，2000 rpm，離心5 min。棄上清，加入4 ml的PBS，并用移液槍輕輕吹打混勻，然后，2000 rpm，離心5 min。棄上清后，再用1 ml的PBS重復洗滌1次。棄上清，放置冰上。配制含1%膽堿脂酶抑制劑（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的細胞裂解液。向離心管中加入適量現配現用的PMSF細胞裂解液后，置于冰上裂解30 min，每5～10 min漩渦震蕩1次。裂解完成后，置于4℃高速冷凍離心機內，于16 000 rpm下離心15 min，收集上清即所需蛋白原液。取2μl蛋白原樣加18μl的PBS溶液稀釋10倍，與6組BSA蛋白標液樣品一起點樣到96孔板上，其中，每孔蛋白液樣品5μl，蛋白定量液96μl，每個蛋白液點3個孔，點樣完成后，在37℃的搖床上震蕩，孵育30 min。使用酶標儀檢測96孔板內蛋白在A492波長下的吸光度值，并通過Excel表格制作出標準曲線，得出計算公式，算出蛋白原液的濃度。采用Biostep Photoimpact凝膠分析系統軟件測量各組目的蛋白與β‐actin條帶的平均光密度值,計算兩者的比值，進行相對定量。將經過去除雌激素影響的細胞用無酚紅培養基培養作為對照組，比較SGC7901研究組和SGC7901對照組中Snail+細胞含量、Snail蛋白表達情況。將SGC7901、High36及Low36細胞中ER‐α36蛋白的表達情況進行比較。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組均數間比較采用t檢驗；多組均數間比較采用F檢驗，多組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤細胞球體內Snail+細胞含量及Snail蛋白的表達

SGC7901對照組的Snail+細胞含量明顯高于SGC7901研究組，差異有統計學意義（P＜0.01）。而SGC7901對照組的Snail蛋白表達低于SGC7901研究組，差異有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 腫瘤細胞球體內Snail+細胞含量及Snail蛋白的表達（± s）

表1 腫瘤細胞球體內Snail+細胞含量及Snail蛋白的表達（± s）

組別SGC7901對照組SGC7901研究組t值P值40.12±3.21 0.33±0.07 27.711 0.001 0.66±0.12 1.13±0.11 6.456 0.030 Snail+細胞含量（%）Snail蛋白（g/L）

2.2 ER- α36對胃癌腫瘤干細胞樣細胞生長的影響

Western blot檢測結果顯示，SGC7901對照組、High36組、Low36組ER‐α36蛋白和Snail蛋白的表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。High36形成的腫瘤細胞球數量多于SGC7901對照組，而Low36形成的腫瘤細胞球數量低于SGC7901對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。上調ER‐α36細胞High36組的腫瘤細胞球體內Snail蛋白的表達高于SGC7901‐對照組，而Low36組的腫瘤細胞球體內Snail蛋白的表達低于SGC7901‐對照組（P＜0.05）。（表2）

表2 SGC7901、High36及Lo-w36細胞中ER‐ α36蛋白和Snail蛋白的表達（g/L，± s）

表2 SGC7901、High36及Lo-w36細胞中ER‐ α36蛋白和Snail蛋白的表達（g/L，± s）

注：*與SGC7901對照組比較，P＜0.05

細胞SGC7901對照組High36 Low36 F值P值1.00±0.01 1.61±0.13*0.36±0.09*233.468 0.000 1.00±0.01 2.21±0.13*0.27±0.08*615.449 0.000 ER‐α36蛋白Snail蛋白

2.3 不同濃度ER預處理對于ER- α36和Snail表達的影響

低濃度ER處理組懸浮培養的腫瘤細胞球體內Snail蛋白和ER‐α36的表達高于無ER處理的對照組（P＜0.05）；而高濃度ER處理組懸浮培養的腫瘤細胞球體內Snail蛋白和ER‐α36的表達，低于無ER處理的對照組（P＜0.05）。（表3）

表3 不同濃度ER處理后各組腫瘤細胞球體內ER‐ α36和Snail的表達（g/L，± s）

表3 不同濃度ER處理后各組腫瘤細胞球體內ER‐ α36和Snail的表達（g/L，± s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組1 μmol組0.1 μmol組F值P值1.00±.0.01 0.68±0.13*1.29±0.08*59.679 0.000 1.00±0.01 0.52±0.11*1.93±0.21*136.918 0.000 ER‐α36Snail

3 討論

在體外如何獲得更多的胃癌干細胞，胃癌干細胞的表面標志物有哪些，胃癌組織中腫瘤干細胞的形成機制，這些都是研究胃癌重要生物學行為所面臨的實際問題。本研究應用超低吸附培養皿懸浮培養胃癌細胞系SGC7901較應用普通培養皿可更多更好地獲得腫瘤細胞球體。對腫瘤細胞球體細胞進行胰酶消化成單個細胞懸液后，全部繼續進行無血清懸浮培養，腫瘤細胞球細胞仍能夠進行分裂增殖，并穩定傳至第4代，即表現出干細胞樣的特征性能力之一，即自我更新的能力。這些腫瘤細胞球體內存在能夠不斷增殖，具有自我增殖的能力，與Deng等[4]的研究結果相似。

Snail作為轉錄因子，其在調節胚胎著床及細胞凋亡方面發揮極大的作用。同時有大量文獻報道，Snail可通過不同途徑促使 EMT[5‐7]，EMT主要在腫瘤早期發生，是腫瘤發生侵襲、轉移及復發的主要原因之一。Snail可促使細胞內E‐鈣黏著蛋白及橋粒芯糖蛋白的表達下降，從而使細胞具有遷移性。此外，Snail還可以介導腫瘤細胞存活，誘導腫瘤干細胞形成[8]。在乳腺癌中異常表達的Snail，不僅能夠提高腫瘤細胞形成具有乳腺上皮細胞相關特性的微球體和腫瘤種植能力，還能夠提高腫瘤細胞表達干細胞相關表面標志物的能力。此外，Snail可以有效地介導細胞存活，并使細胞具有干細胞樣特性。Sato等[9]在長期暴露于尼古丁中的口腔上皮中發現，敲除Snail基因后，腫瘤干細胞性能的增強及EMT得到逆轉。由此推測，Snail可能也作為腫瘤干細胞標志物通過某一信號傳導通路調節胃癌腫瘤干細胞的生長[10]。Snail蛋白作為參與EMT及誘導腫瘤干細胞存在的重要分子，其在胃癌腫瘤干細胞中的作用機制有待進一步研究。

新近發現的雌激素受體ER‐α36是ER‐α的新亞型，在ER‐α66陰性的乳腺癌中，ER‐α36通過激活多條信號通路刺激乳腺癌細胞生長，ER‐α36在組織中的表達與ER‐α66的表達呈負相關性，并且在ER陰性的乳腺癌中，Snail表達明顯升高[12]。前期有研究發現，胃癌的發生發展與ER‐α36介導的雌激素之間也存在相關性，ER‐α36介導的雌激素信號能夠促進SGC7901細胞增殖與侵襲[13]。因此，推測ER‐α36介導的雌激素信號可能與形成胃癌腫瘤干細胞有關，但目前未見相關報道。

在得到上述結果及前期研究結果的基礎上，又應用無血清以及超低吸附培養皿懸浮培養胃癌細胞系SGC7901及SGC7901重組細胞系High36和Low36，并對SGC7901腫瘤細胞球進行不同濃度的ER（1 μmol、0.1 μmol）處理。應用倒置顯微鏡觀察各組腫瘤細胞球的大小和形狀，并在鏡下利用熱點計數法計算腫瘤細胞數目，結果顯示，低濃度ER和ER‐α36蛋白上調均與促進腫瘤細胞球的形成有關。另外，本項研究還對各組腫瘤細胞球中細胞進行傳代，繼續無血清懸浮培養，計數每一代腫瘤細胞球中的細胞數。本研究發現，低濃度ER和上調ER‐α36均與促進腫瘤細胞球細胞分裂增殖有關（P＜0.05）。此外，通過對不同濃度ER處理形成的腫瘤細胞球及重組細胞系High36和Low36腫瘤細胞球中Snail蛋白表達的檢測中發現，在低濃度ER處理懸浮培養的細胞腫瘤細胞球中Snail蛋白高表達的同時，伴有ER‐α36表達的升高，而高濃度的ER處理作用卻相反。最新的研究發現，Snail參與ER‐α促進EMT過程，并促進腫瘤的增殖和侵襲轉移[14]，針對性地抑制ER‐α表達，同時也抑制了Snail蛋白的表達[15‐16]。因此，根據已有的實驗數據結果顯示，推測ER‐α36‐Snail信號可能具有促進CSC樣細胞生長作用，Snail通過ER‐α36介導的雌激素信號在胃癌腫瘤干細胞中的作用機制有待我們進行下一步的深入研究。

綜上所述，本研究應用超低吸附皿無血清懸浮培養的方法，可穩定獲得能夠不斷增殖、具有自我更新能力的胃癌腫瘤細胞球體。Snail在這些腫瘤細胞球體內細胞含量明顯增高，且Snail蛋白也呈中高表達，低濃度ER刺激可以誘導Snail及ER‐α36的高表達。因此，Snail在ER‐α36信號通路促進胃癌腫瘤干細胞樣成球中可能具有重要作用。

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