非小細胞肺癌移植瘤侵襲組織中血清蛋白的分布

白玉勤 吳 　寶 張 　龍劉曉輝 其木格 劉帥瑩韋學磊 王　徽

（1. 赤 峰學院醫學院病理學教研室，內蒙古　赤峰 　024000；2. 赤 峰學院附屬醫院病理科，內蒙古 　赤 峰 　024005；3. 赤 峰學院醫學院組織胚胎學教研室，內蒙古 　赤 峰 　024000；4. 赤峰學院附屬醫院輸血科，內蒙古　赤峰　024005；5. 赤峰學院附屬醫院神經內科，內蒙古 　赤 峰 　024005）

腫瘤微環境是影響腫瘤發展和轉移的關鍵因素[1]。許多研究采用病理檢查的石蠟切片進行評估分析腫瘤微環境，但傳統標本制備過程中的固定和脫水等影響腫瘤微環境的精準分析[2-3]。由日本山梨大學大野伸一教授研制開發的活體冷凍技術(in vivo cryotechnique，IVCT)是活體狀態下冷凍固定動物靶器官，揭示了血液流動狀態下的組織細胞結構，克服了傳統標本制作方法血流中斷帶來的弊端[4]。我們利用IVCT技術不僅在小鼠肝臟、腎臟、卵巢等器官上清晰觀察到血清蛋白(serum proteins)，如Albumin、IgG、IgA、IgM等，而且在異種移植人非小細胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC) 模型上首次清晰觀察到血清蛋白分布，避免了傳統標本制作方法導致的人工假象(artifacts)，提出了腫瘤間質及細胞外基質的血清蛋白分布與其相對分子質量密切相關[5-6]，研究發現在A549移植瘤周邊和中心區域的血清蛋白如Albumin、IgG1、IgM的分布不同[6]，為了進一步研究A549移植瘤周邊區域(侵襲組織)血清蛋白分布情況，本研究再次利用凍存的A549細胞，在日本山梨大學醫學部動物實驗室制作模型，在大野教授指導下制備冷凍標本，探討移植瘤侵襲組織血清蛋白分布與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和表皮生長因子受體(epidermal g rowth f actor r eceptor，EGFR)的關系。

1　材料與方法

1.1　實驗動物及移植瘤模型的建立

1.1.1實驗動物 本動物實驗經日本山梨大學動物保護與使用委員會批準。雄性BALB/c品系(BALB/c-nu/nu)裸鼠20只，購于日本SLC株式會社，鼠齡為7～8周，動物模型建立和飼養均在日本山梨大學動物實驗室SPF條件下的超凈工作臺中進行。

1.1.2肺癌細胞系 非小細胞肺癌A549細胞由日本東北大學生物醫學研究所提供，在日本山梨大學醫學部解剖分子教研室的細胞培養室常規傳代培養[7]，細胞培養于含20%小牛血清的RPMI-1640培養液中。

1.1.3腫瘤移植 運用細胞培養移植法，先進行A549細胞培養并傳代，收集約5×106個細胞接種到裸鼠背部靠近頭部皮下，接種后觀察腫瘤的生長情況，于第2周開始使用游標卡尺在體外分別測量瘤體長徑和寬徑，采用的體積計算公式為1/2×(長徑)×(寬徑)2，待腫瘤體積達到1 000 mm3時進行病理形態學觀察。

1.2　儀器和試劑

1.2.1主要儀器設備 牙科電鉆，磁力攪拌器，低溫冰箱，轉輪切片機，白色透明濕盒，五片直立瓶，羅紋口玻璃瓶，防脫片，顯微鏡。

1.2.2主要試劑 多聚甲醛，丙酮，異戊烷，丙烷，液氮，干冰。魚明膠，購于Sigma公司；羊抗鼠血清蛋白(albumin)、免疫球蛋白G1和M(IgG1、IgM)、兔抗人VEGF和EGFR單克隆抗體、羊抗兔IgG，均購自邁新生物技術開發公司；兔抗羊IgG，購于Vector Laboratories；二氨基聯苯胺(3′，3-diaminobenzidine，DAB)試劑盒。

1.3　標本的制備

帶有移植瘤的裸鼠用乙醚麻醉，剪開背部皮膚暴露移植瘤進行活體冷凍固定并制備標本[8]。用-196 ℃液氮致冷的異戊烷-丙烷冷凍液(-193 ℃)冷凍固定移植瘤，在液氮里用牙科電鉆取下腫瘤組織后，移到-80℃干冰預冷的2%多聚甲醛-丙酮液中進行冷凍置換[6]。冷凍置換是固定在2%多聚甲醛-丙酮液的冷凍標本逐漸升溫從-80 ℃到室溫的過程。移植瘤冷凍置換后用聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物或石蠟包埋劑包埋，進行冰凍或石蠟切片，顯微鏡下觀察。

1.4　免疫組織化學染色

石蠟標本3 μm連續切片后貼附于含MAS的防脫載玻片(購于日本Matsunami Glass)。一部分切片進行蘇木精-伊紅染色，另一部分切片經二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，最后蒸餾水水化后用PBS沖洗，用于免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色。IHC采用親和素-生物素-過氧化物酶(ABC)法。首先用1%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶活性，2%魚明膠溶液封閉。PBS漂洗3次，分別滴加一抗羊抗鼠血清蛋白(albumin)、 免 疫 球 蛋 白 G1和 M(IgG、 IgM)(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX，USA)，兔抗人VEGF和EGFR單克隆抗體，4 ℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗后滴加與第一抗體種屬匹配的二抗兔抗羊IgG或羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。DAB顯色，采用蘇木精進行細胞核淡染，梯度酒精脫水后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。每次染色均設空白對照(PBS)和自身陽性對照。自身陽性對照是在同一切片上與檢測的目的物對照比較。如albumin在血管腔內應為陽性，IgG1和IgM在某免疫細胞漿或血管腔內應為陽性，EGFR和VEGF在紅細胞膜或某梭形細胞漿應為陽性。

1.5　判斷標準

根據免疫組化染色程度分為強陽性(+++)、中度陽性(++)和弱陽性(+)，無著色為陰性(-)。在連續切片上對NSCLC(包括血管、腫瘤周圍結締組織、腫瘤間質、腫瘤細胞外基質、免疫細胞)的albumin、IgG1和IgM蛋白表達程度進行統計，VEGF和EGFR蛋白免疫組化染色在胞膜或細胞漿呈棕色判斷為陽性，無著色為陰性。

2　結果

2.1　Albumin、IgG1和IgM在NSCLC移植瘤侵襲組織的分布

A549移植瘤侵襲組織HE染色和albumin、IgG1、IgM蛋白免疫組織化學染色結果見圖1。可見在HE切片上NSCLC侵襲組織觀察到擴張的血管及血管內流動的紅細胞，癌細胞核及清晰的核仁，豐富的細胞漿，并且細胞與細胞間連接比較緊密。Albumin免疫組化染色在血管、癌周圍結締組織、細胞外基質及腫瘤間質呈強-中度陽性。IgG1免疫組化染色在血管和腫瘤周圍結締組織呈中度陽性，在腫瘤間質和細胞外基質呈弱陽性。IgM免疫組化染色在血管和腫瘤周圍纖維結締組織呈中度陽性，但是在腫瘤間質和癌細胞外基質呈陰性。IgG1和IgM在免疫細胞中呈強陽性，半定量分析見表1。

圖1　A549移植瘤侵襲組織HE染色和albumin、IgG1、IgM蛋白免疫組織化學染色圖片(×200)

表1　NSCLC侵襲組織albumin、IgG1和IgM表達的半定量分析

2.2　VEGF和EGFR蛋白在NSCLC移植瘤侵襲組織的分布

VEGF免疫組化染色(圖2A和2B)在腫瘤周圍纖維結締組織和間質內某梭形細胞膜陽性表達，血管內皮細胞和紅細胞膜也呈陽性表達，癌細胞漿呈細顆粒狀陽性表達。EGFR蛋白(圖2C和2D)在腫瘤周圍纖維結締組織和間質內某梭形細胞質和細胞膜陽性表達，血管內皮細胞和紅細胞膜陽性表達，但是癌細胞漿和膜未見VEGF蛋白表達，呈陰性。

3　討論

動物切除組織制作病理學標本過程中，通過化學固定和酒精脫水步驟，通常會導致組織收縮、分子易位和抗原封閉[9，11]等，產生人工假象。IVCT技術是瞬間冷凍固定組織和細胞，防止了傳統化學固定的弊端。本研究采用A549細胞異種移植模型，通過IVCT 技術制備的NSCLC標本，觀察HE染色的侵襲組織的組織學特點，并進行albumin、IgG1和IgM免疫組化染色分析。IVCT技術制備標本的HE形態同樣觀察到均勻紅染的細胞外基質，沒有因傳統標本制備方法而導致細胞收縮的縫隙[6]。清晰觀察到利用IVCT制備NSCLC侵襲組織的albumin、IgG1和IgM免疫組織化學染色分布，半定量分析進一步說明了移植瘤侵襲組織不同分布，在腫瘤細胞外基質的免疫組織化學分布有可能與它們的分子量密切相關。另外，還有可能與血清蛋白的電荷及血管構造有關，反映了NSCLC侵襲組織腫瘤細胞間復雜相互作用導致局部微環境的改變。

圖2　A549移植瘤侵襲組織VEGF和EGFR蛋白免疫組織化學染色分布

VEGF是作用最強的促血管形成因子之一，它可以通過與其特異性受體結合引起一系列的信號轉導，釋放多種細胞因子與生長因子，促進血管內皮細胞增生和血管形成，增加血管通透性，并且參與肺癌浸潤和轉移[12]。我們研究了BI6-BL6黑色素瘤細胞移植瘤組織IgM免疫組化表達與線粒體功能的關系[13]，并且在Lu99和Lu65移植瘤組織中討論了VEGF、vWF和IgM三者的關系[8]，得出了腫瘤細胞胞漿VEGF強陽性區域的細胞外基質中IgM免疫組化染色陰性，證明了Lu99和Lu65移植瘤組織VEGF強陽性區域的血管壁不能透過大分子量IgM，發現了NSCLC組織的功能性血管。本研究中明確提出NSCLC侵襲組織癌細胞VEGF和EGFR蛋白表達，發現了VEGF蛋白在癌細胞漿、間質梭形細胞、血管內皮細胞及紅細胞膜或漿均陽性表達，但是EGFR蛋白在A549移植瘤侵襲組織癌細胞漿或膜陰性表達，在間質梭形細胞、血管內皮細胞及紅細胞膜或漿陽性表達。圖1和圖2說明了A549移植瘤侵襲組織細胞外基質血清蛋白質albumin、IgG1、IgM的免疫組化染色分布與VEGF和EGFR表達無關。據文獻報道，Weiss等[14]認為EGFR蛋白表達與microRNA-128b調節密切相關。并且EGFR參與多種信號途徑促進血管形成和腫瘤細胞增殖。Nicholson等[15]研究分析了1985年到2000年發表的有關EGFR與癌預后的文獻，不同的研究其結果也不同，產生這些差異可能與標本數量和缺乏標準化的免疫組織化學判定標準等有關。我們通過IVCT技術，清晰顯示了A549移植瘤侵襲組織EGFR 蛋白分布，證明了EGFR表達與腫瘤細胞侵襲無關。

綜上所述，在異種移植A549細胞模型上，IVCT技術制備的標本采用免疫組化染色分析albumin、IgG、IgM、VEGF和EGFR蛋白分布，清晰觀察到albumin、IgG1 和IgM在移植瘤侵襲組織細胞外基質的不同分布，有可能與其分子量有關，與VEGF和EGFR蛋白分布無關。

(感謝日本山梨大學醫學部解剖分子組織學教研室大野教授大力支持)

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