農藥哌蟲啶的遺傳毒性試驗

夏 　瑩，付少華，張寅靜，王 　薇

（湖北省疾病預防控制中心，湖北省預防科學院，湖北 　武 漢 　430065）

農業產業化的發展使農產品的生產越來越依賴于農藥等外源物質。我國農藥的用量居高不下，隨著過去使用的許多農藥被檢測出具有致突變、致畸和致癌性，新上市的農藥品種也越來越多，對這些品種農藥的快速評價成為目前亟待解決的問題。目前已建立的短期遺傳毒理學試驗較多，這些試驗方法耗時短、價廉、靈敏度高，在農藥、化學品暴露的生物學效應評價中取得了較好的評價效果。農藥哌蟲啶是一種新煙堿類殺蟲劑，具有高效、廣譜等特點，本研究采用哌蟲啶進行體外CHO-K1細胞HGPRT基因突變試驗和小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗，旨在短期內分析農藥哌蟲啶是否具有遺傳毒性。

1　材料與方法

1.1　HGPRT基因突變試驗[1]

1.1.1試劑及儀器 細胞株及來源：中國地鼠卵巢(CHO-K1)細胞株，購于中國典型培養物保藏中心，采用DMEM/F12培養基(含10 %胎牛血清及1%雙抗)，37.0℃、CO2體積分數為5%的條件下培養。代謝活化系統：代謝活化劑為哺乳動物肝微粒體酶活化系統(S9)，購自美國Moltox公司，批號4027。每毫升S9 mix的成分為S9 1.25 mL，MgCl2(0.4 mol/L) 0.2 mL，KCl(1.65 mol/L) 0.2 mL，葡萄糖-6-磷酸17.91 mg，輔酶Ⅱ(氧化型，NADP)30.615 mg，用無血清DMEM/F12 培養液補足至10 mL。主要儀器：SANYO MCO-18AIC 二氧化碳培養箱，SW-CJ-2F超凈工作臺。主要試劑：95%哌蟲啶原藥，江蘇克勝公司提供；3-甲基膽蒽(methylcholanthrene，MCA，2.0 μL/mL)，美國Sigma 公司生產，批號LB83414V；甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone，EMS，0.25 μL/mL)美國Sigma公司生產，批號BCBC4573V；以上試劑均用0.5%二甲基亞砜(DMSO，國藥集團生產)溶解，批號20121130；6-巰基鳥嘌呤(6-mercaptopurine，6-TG)，美國Sigma公司生產。

1.1.2劑量設計與分組 根據預實驗結果以625.0 μg/mL作為最高劑量(無細胞毒性，有可見沉淀)，以下劑量依次為312.5、156.3、78.1 μg/mL，同時作陰性對照組和陽性對照組。陰性對照組給予無菌DMSO(+S9/-S9)；陽性對照組給予3-甲基膽蒽(+S9)、甲基磺酸乙酯(-S9)。

1.1.3突變試驗 將經6-硫代鳥嘌呤篩選，選擇生長良好的CHO-K1細胞用0.25%胰酶消化處理，用含10%胎牛血清的培養基制成細胞懸液(1.5×106/mL)，每個培養瓶(25 cm2)接種細胞懸液1.0 mL，另加含10%胎牛血清的培養基4 mL(3.0×105/mL)，置37 ℃、CO體積

2分數為5%的培養箱中培養48 h后，棄其培養液，加入4.5 mL含有陰性、陽性物或不同濃度受試物的培養液(不含血清)，+S9每培養瓶加S9混合液0.5 mL，-S9加入0.5 mL培養液。混勻后，置CO2培養箱培養4 h，棄上清，用D-Hanks液洗滌3次，加入5 mL含10%胎牛血清的培養液，培養20 h。培養7 d后進行突變體的選擇及集落形成率的測定，同時，每個培養皿接種200個細胞，每個劑量組設5個培養皿，7 d后，甲醇固定，Giemsa染色，觀察細胞集落數，計算細胞存活率。培養7 d后，以2×105/皿接種，細胞貼壁后加入6-TG(終濃度為5 μg/mL)，每劑量設5個培養皿。同時另按200/皿接種，每劑量組設5個培養皿。與上述平皿同時放入培養箱7 d，固定、染色，計數集落并計算集落數、存活率(CFE)和突變頻率(mutation frequency，MF)。計算公式為：

絕對CFE=形成集落數/接種細胞數；

相對CFE=試驗組絕對CFE/溶劑對照組絕對CFE×100%；

突變頻率=突變型細胞克隆數/(接種細胞數×克隆形成率)×100%

實驗數據用Microsoft Excel軟件建立數據庫，計量資料采用t檢驗，計數資料采用非參數統計法。

1.2　小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗[1]

1.2.1試驗動物 SPF級昆明小鼠購自湖北省實驗動物研究中心，雌雄各25只。體質量25～30 g。SPF級屏障系統內進行。實驗動物飼養于塑料飼育盒內，每籠5只，籠具、食盒每周更換一次并進行清洗消毒。環境條件：溫度(23±3)℃，濕度40%～70%，12 h/12 h明暗交替，噪音在60 dB以下；換氣次數每小時10～18次。

1.2.2主要儀器和試劑 主要儀器有Olympus CX21顯微鏡。主要試劑有甲醇(國藥集團生產)、吉姆薩染液(美國Sigma公司生產)

1.2.3劑量設計和分組 根據資料該受試物對雌、雄性大鼠的LD50均 大于5 000 mg/kg。按LD50的1/8、1/4、1/2設置低、中、高3個劑量組，分別為625、1 250、2 500 mg/kg，另設陰性對照組和陽性對照組。陰性對照組給予純水，陽性對照組按40 mg/kg給予環磷酰胺(CP)。動物按體質量隨機分為5組，每組小鼠雌性5只，雄性5只。

1.2.4試驗方法 分兩次灌胃給予受試物，間隔24 h，受試樣品各組每次小鼠灌胃容量均為20 mL/kg。于末次給予受試物后22 h處死動物，取股骨做骨髓涂片，自然干燥后用甲醇固定，Giemsa染色。每只動物油鏡下觀察1 000個嗜多染紅細胞，記錄出現微核的嗜多染紅細胞數，其微核發生率以含微核的PCE千分率計；計數200個嗜多染紅細胞數(PCE)，同時計數成熟紅細胞數(NCE)，并計算PCE占紅細胞總數(PCE+NCE)的百分比。

1.3　統計學方法

實驗數據用Microsoft Excel軟件建立數據庫，計量資料采用t檢驗，計數資料采用非參數統計法。

2　結果

2.1　HGPRT基因突變試驗結果

如表1所示，細胞毒性測試表明各組細胞相對存活率均大于50%。如圖1所示，與陰性對照組比較，在活化系統和非活化系統條件下，受試樣品各劑量組細胞基因突變頻率差異均無統計學意義(P＞0.05)，陽性對照組細胞基因突變頻率差異有統計學意義(p＜0.01)。

表1　細胞毒性測試和集落形成率(n=200)

圖1　各受試物對基因位點突變頻率的影響

2.2　小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結果

小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結果數據見表2。結果表明，受試物各組未成熟紅細胞占紅細胞總數的比例[PCE/(PCE+NCE)總數]均不少于陰性對照組的20%；與陰性對照組比較，陽性對照組雌雄小鼠微核率明顯增加(p＜0.01)，而受試樣品各劑量組雌雄小鼠微核率差異均無統計學意義(P＞0.05)，表明該受試樣品骨髓細胞微核試驗結果為陰性。

3　討論

農藥哌蟲啶HGPRT基因突變試驗與小鼠微核試驗結果均為陰性，在本實驗條件下未發現致突變性。化學有害物質導致的DNA損傷后主要表現為體細胞基因突變，此突變可導致發生多種疾病，并和腫瘤的發生關系密切，在化學物質導致基因突變作用中占有特殊地位[2]。在檢測體細胞基因突變體系中，HGPRT基因突變是一種常用的方法，在有關化學物質遺傳毒性檢測策略的文獻中也提到，為有效鑒定物質是否具有致突變性，一組小型試驗中應當含有哺乳動物細胞突變試驗[3]。因此，在評價農藥哌蟲啶遺傳毒性的體外試驗中，能夠對體細胞的基因突變進行準確檢測分析的方法常作為必選方法。有研究顯示，應用中國倉鼠卵巢細胞CHO/ HGPRT基因突變試驗方法，43種已知的具有致癌性化學物質中的40種化學物質在該試驗結果中為陽性[4]。并且哌蟲啶HGPRT基因突變試驗結果還可為后續致癌性評價試驗提供劑量參考。有幾項研究中提到，微核試驗在敏感性、準確性和特異性方面與染色體畸變試驗方法幾乎相當[5-6]。由于微核試驗方法具有簡便、快速、試驗結果可信度高[7]、可在較短時間內檢出染色體損傷效應、背景清楚、影響因素少、易重復等特點，故可被應用于哌蟲啶的遺傳毒理學中的染色體損傷的檢測之前。此外，體內微核試驗往往采用適合濃度的化合物處理，符合體內的正常生理狀態，故在哌蟲啶的安全性評價上更具生理學意義。

表2　哌蟲啶原藥試驗結果(n=5)

[1] 中華人民共和國農業部. GB 15670-1995 農藥登記毒理學試驗方法[S]. 北京：中國標準出版社，1995：8.

[2] JAMES T M，DANIEL C，LUTZ M. Strategies and testing methods for identifying mutagenic risks[J]. Mutat Res，2000，455(1)：3-20.

[3] THYBAUD V，AARDEMA M，CLEMENTS J，et al. Strategy for genotoxicity testing：hazard identification and risk assessment in relation to in vitro testing[J]. Mutat Res，2007，627(1)：40-58.

[4] KARGALIOGLU Y，MCMILLAN B J，MINEAR R A，et al.Analysis of the cytotoxicity and mutagenicity of dringking water disinfection by-products in Salmonella typhimurium[J]. Teratog Carcinog Mutagen，2002，22：112-128.

[5] GALLOWAY S M，MILLER J E，ARMSTRONG M J，et al.DNA synthesis inhibition as an indirect mechanism of chromosome aberrations：comparison of DNA-reactive and non-DNA-reactive clastogens[J]. Mutat Res，1998，400(1)：168-186 .

[6] AMES B N， MCCANN J， YAMASAKI E. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test[J]. Mutat Res，1975，31(6)：346-364.

[7] 王心如. 毒理學實驗方法與技術[M]. 北京：人民衛生出版社，2003.