三磷酸腺苷二鈉氯化鎂對宮內窘迫胎鼠腦保護作用的研究

張陳彥，都治香，祁美玉，趙敏英，張銘娜，張立新，安雪麗

（1.石家莊市第一醫院產科，河北石家莊 050011；2.河北醫科大學第一醫院婦產科，河北石家莊 050000）

新生兒缺氧缺血性腦病是新生兒死亡最常見的原因，一些幸存者可能會遺留嚴重的長期的神經性殘疾，包括腦癱和神經發育延遲。新生兒腦缺氧損傷的嚴重程度與受多個保護性或有害因素的相互作用結果密切相關。但導致這些調控因素的原理機制還不完全明白。動物實驗及臨床研究已證實，缺氧缺血可造成神經元死亡。對缺血缺氧的干預，可減少缺氧缺血后的腦損傷。圍產期的缺血缺氧對新生兒腦損傷的預后有至關重要的影響［1］。但治療胎兒缺氧導致的新生兒大腦缺氧缺血性腦病仍然遙遙無期。本研究的目的是制備宮內窘迫胎鼠模型調查三磷酸腺苷二鈉氯化鎂對缺血缺氧性腦損傷腦細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型的分組和建立 取同批成年雌性Sprague-Dawley大鼠15只，孕鼠隨機分為缺血缺氧再灌注組（I／R組）和假手術（Sham組）、三磷酸腺苷二鈉氯化鎂治療組（T／M組）三組，每組各5只。于妊娠第19天以3.5%水合氯醛（1 mL／100 g）腹腔注射麻醉，通過無損傷動脈鉗鉗夾雙側子宮、卵巢血管20 min建立缺血缺氧宮內窘迫模型。T／M組缺血前30 min，45 mg·kg-1三磷酸腺苷二鈉氯化鎂腹腔注射，Sham組和I／R組于相同時間給予同等體積的0.9%氯化鈉注射液。Sham組只進行開關腹手術，不鉗夾子宮卵巢動脈。各組孕鼠缺氧20 min后拆除動脈夾以恢復血供，并逐層關腹。各組均于手術后24 h取標本。

1.2 方法 各組均于關腹后24 h剖宮取胎，先確定胎鼠是否存活，點清死胎數，在每組存活胎鼠中隨機抽取10只斷頭取腦，剝離頭皮，沿前囟剪開顱骨，取全腦標本。于視交叉起始向尾側，冠狀切面厚2mm，標本置于4%多聚甲醛浸泡24 h經乙醇脫水后用石蠟浸泡并制成蠟塊。據大鼠腦立體定位圖譜，取丘腦中1／3平面，水平冠狀切片厚5μm，制成石蠟切片。

1.3 指標檢測 于術后24 h以3.5%水合氯醛對孕鼠行腹腔麻醉，開腹并暴露雙側子宮，觀察宮腔內的活胎數，剖出胎鼠并觀察存活新生鼠皮膚顏色、四肢運動等情況。計算胎鼠死亡率。取胎鼠，斷頭處死，取出完整胎腦，于4%多聚甲醛固定48 h，經脫水透明后石蠟包埋切片，備用。

取胎鼠腦組織，濾紙拭干，稱質量后，加入4℃的HEPES緩沖液中，其體積是腦組織塊質量的9倍，用玻璃勻漿器制成勻漿，勻漿液以3 000 r·min-1離心15 min，分裝于-70℃冰箱中保存備用。按試劑盒說明書，利用分光光度計檢測胎鼠腦組織的丙二醛（MDA）水平。MDA試劑盒，購于南京建成科技有限公司。

固定后的組織分置于40 g·L-1多聚甲醛中4℃后固定，常規脫水，石蠟包埋后切片，脫蠟，行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組織形態學改變。

1.4 統計學方法 采用 SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計量資料以表示，多組間比較為單因素方差分析＋LSD-t檢驗。計數資料以例數及率表示，比較采用整體＋分割χ2檢驗。以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組胎鼠死亡率 I／R組胎鼠死亡率23.31%，明顯高于 Sham組（p＜0.05），T／M組胎鼠死亡率15%，較I／R組顯著降低（p＜0.05）。見表1。

表1 各組胎鼠死亡率

2.2 胎鼠腦組織MDA表達 與Sham組比較，I／R組胎鼠腦組織MDA含量顯著增高（p＜0.05），但T／M組胎鼠腦組織MDA活性顯著降低（p＜0.05）。見表2。

表2 各組胎鼠心組織中MDA的變化

2.3 腦組織HE染色病理學變化 光鏡下Sham組細胞層次清晰，腦細胞完整，細胞形態正常，未見明顯損傷性改變（見圖1）。T／M組細胞排列紊亂，組織疏松水腫，神經細胞及膠質細胞變性（見圖2）。I／R組可見細胞結構層次紊亂加重，細胞水腫組織疏松水腫更加嚴重，細胞皺縮，核濃縮，胞質內核碎片，尚可見單個圓形凋亡小體，還有部分壞死病灶，周圍可見炎性細胞浸潤（見圖3）。

圖1 Sham組病理圖（HE×10）

圖2 T／M組病理圖（HE×10）

圖3 I／R組病理圖（HE×10）

3 討論

妊娠期缺氧是影響胎兒發育和增加新生兒發病風險的常見原因。圍產期新生兒腦損傷是缺氧缺血性腦病最常見的原因［2］。缺氧缺血性損傷影響胎兒或新生兒的中樞神經系統發育［3］。雖說缺氧缺血性腦病的發病機制尚不明確，但近年來的研究表明，不良宮內環境可能造成腦發育異常［4］。缺氧是宮內創傷中一種常見形式，和胎兒在經歷長時間各種可能缺氧的條件密切相關，包括在高海拔地區懷孕、妊娠合并貧血、胎盤功能不全、脊髓壓迫、先兆子癇、合并心臟、肺和腎臟疾病、或血紅蛋白病等。研究表明，胎兒缺氧影響新生兒正常的大腦發育和導致各種的神經功能缺損［5］。

新生兒缺血缺氧性腦病的發病機制復雜，一般認為，腦能量代謝障礙、氧自由基損害、鈣離子失衡及興奮性氨基酸毒性作用是引起缺血細胞死亡的關鍵環節。三磷酸胞苷二鈉是一類腺苷酸藥物，對神經細胞內的核酸、磷脂及蛋白質等成分的合成及代謝有促進作用，能調節神經細胞的生物膜合成，使神經細胞的抗損傷能力增強，還可營養神經細胞，使神經細胞的凋亡速度得以延緩［6］。鎂，稱為“高能離子”是細胞內第二個最豐富的陽離子，超過300種酶的輔因子，其中一些催化氧化磷酸化，激活能量儲存和代謝ATP。此外，鎂離子參與細胞膜的調節滲透性和動脈壓?？赡芤蚣毎麅華TP和ADP存在鎂復合物和ATP酶需要鎂作為輔因子，氯化鎂能增強三磷酸腺苷的作用。

各種不利的循環條件下如低血容量休克、局部缺血和敗血癥等各種損傷中，給予外源性的三磷酸腺苷二鈉氯化鎂能夠改善亞細胞、細胞或器官的功能，糾正或改善動物休克后的生存率［7］。三磷酸腺苷二鈉氯化鎂能夠提高第二信使cAMP和IP3的基礎水平，在出血性休克時降低其在膜信號傳導過程中的損傷。因此，發生失血性休克時經三磷酸腺苷二鈉氯化鎂處理對細胞膜功能的有有利影響［8］。在缺血缺氧的狀態下，心血管系統會改變心率，心輸出量重新分配，以保護有限的能源資源，保持大腦足夠的能量供給［9］。且三磷酸腺苷二鈉氯化鎂對脊髓損傷有保護作用［10］。鎂離子還可促進氧與產婦和胎兒血紅蛋白的結合，提高子宮胎盤的血流速度，從而提高產婦與胎兒之間的物質交換，提高胎盤的功能［11］。ATP對缺血缺氧損傷的保護作用機制是三磷酸腺苷二鈉氯化鎂可以直接提供對細胞內鈉離子的能量或能量底物-鉀-ATP酶以及鈣-ATP酶保留在細胞外和細胞內的離子平衡，減輕細胞內酸中毒和細胞腫脹。此外，三磷酸腺苷氯化鎂也對微循環的改善效果，修復膜的電壓，恢復正常膜的滲透性和細胞功能的改進［12］。氯化鎂的二價陽離子抑制ATP的螯合作用，并且抑制ATP的脫氨基作用和去磷酸化，從而維持組織的高ATP水平。圍產期腦損傷后細胞凋亡較顯著。由于三磷酸腺苷二鈉氯化鎂的神經保護作用，可以降低新生兒缺氧缺血腦病的風險。

本實驗中 I／R組胎鼠死亡率明顯高于Sham組，T／M組胎鼠死亡率較缺血缺氧組顯著降低，從而證實三磷酸腺苷二鈉氯化鎂可以降低宮內窘迫胎鼠死亡率，提高存活率。本研究病理組織學結果提示，光鏡下Sham組細胞層次清晰，腦細胞完整，細胞形態正常，未見明顯損傷性改變。無水腫，無核濃縮，無核碎片，凋亡小體少見，并且未見壞死灶。I／R組可見細胞水腫，細胞皺縮，核濃縮，胞質內核碎片，尚可見單個圓形凋亡小體，還有部分壞死病灶，周圍可見炎性細胞浸潤；T／M組上述現象明顯減少、減輕。提示三磷酸腺苷二鈉氯化鎂在減輕宮內窘迫胎鼠腦組織損傷方面有明顯的保護作用。

三磷酸腺苷二鈉氯化鎂降低缺血再灌注過氧化產物，從而減弱線粒體的脂質過氧化作用，達到清除氧自由基的功能［9］。而組織中MDA水平可用于測定組織中的氧化應激狀態，是反映自由基損傷程度的重要指標［13］。本組實驗的結果提示，與Sham組比較，I／R組胎鼠腦組織MDA含量顯著增高，但T／M組胎鼠腦組織MDA活性顯著降低，提示三磷酸腺苷二鈉氯化鎂能夠減少MDA生成，從而減輕組織的脂質過氧化損傷，減輕宮內窘迫胎鼠腦損傷方面有明顯的保護作用。此理論提示三磷酸腺苷二鈉氯化鎂可以是治療新生兒缺氧缺血性腦病的選擇。這種療法應進行確認的臨床療效研究論證。

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