姜黃素對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元GAP—43表達(dá)變化的影響

王笑音

【摘要】 目的：探討姜黃素對(duì)大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后神經(jīng)元神經(jīng)生長(zhǎng)蛋白43（growth associated protein，GAP-43）表達(dá)的影響。方法：制作SCI模型，分為假手術(shù)組、生理鹽水治療組、姜黃素治療組，每組25只。用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)神經(jīng)元GAP-43的表達(dá)變化，檢測(cè)動(dòng)物術(shù)后BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：姜黃素治療組較生理鹽水治療組，GAP-43含量較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；姜黃素治療組的BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)明顯優(yōu)于生理鹽水治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：姜黃素能夠改善SCI區(qū)域的微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 姜黃素； 脊髓損傷； GAP-43

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.5.088 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2018）05-0171-02

姜黃素（Curcumin）是從姜黃、郁金、莪術(shù)、石菖蒲等根莖提取的一種黃色酸性植物多酚，具有抗氧化、抗炎、降血脂、抗凝、抗纖維化及抑制腫瘤生長(zhǎng)等多種藥理作用[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以通過抑制鈣超載、抗蛋白質(zhì)聚積改善神經(jīng)損傷后的微環(huán)境，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4]。這里筆者通過使用姜黃素治療脊髓損傷，觀察神經(jīng)細(xì)胞GAP-43表達(dá)和神經(jīng)功能恢復(fù)，探討姜黃素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑

1.1.1 動(dòng)物 選取75只體重250～300 g的SD雌性大鼠，動(dòng)物隨機(jī)分三組，即假手術(shù)組、生理鹽水治療組和姜黃素治療組，每組25只。

1.1.2 試劑 姜黃素、GAP-43抗體、生物素化羊抗小鼠IgG、ABC試劑。

1.2 動(dòng)物模型

脊髓損傷模型：腹腔注射戊巴妥鈉麻醉大鼠，四肢固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，切開后背正中皮膚，分離皮下組織和肌肉，咬除T9～T10棘突和椎板，露出脊髓組織，用手術(shù)刀快速向一側(cè)半切斷脊髓，沖洗縫合傷口，注射抗生素預(yù)防感染。

姜黃素治療組每天給予腹腔注射姜黃素100 mg/kg，1周后停藥[5]，生理鹽水治療組用0.9%Nacl代替姜黃素，假手術(shù)組僅給予抗感染治療。

1.3 取材和切片

術(shù)后1、3、7、14、21 d每組各處死5只動(dòng)物取材。腹腔注射戊巴妥鈉麻醉大鼠，剪開胸腔，將針頭從左心室插入至升主動(dòng)脈，迅速切開右心房，快速灌注0.9%Nacl 250 ml，待液體清亮立刻灌注4%多聚甲醛300 ml，咬除棘突和椎板，暴露脊髓組織，取損傷區(qū)脊髓組織，行石蠟包埋切片。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

切片滴加GAP-43抗體，放置4 ℃過夜，PBS洗3次，每次5 min；滴加生物素化羊抗小鼠IgG，4 ℃孵育12 h，PBS洗3次，每次5 min，滴加ABC試劑，DAB染色，蘇木素復(fù)染。

鏡下觀察到黃色神經(jīng)細(xì)胞即為GAP-43陽性細(xì)胞，每只動(dòng)物取5張切片，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞總數(shù)，取每個(gè)時(shí)相5例動(dòng)物的平均值。

1.5 行為學(xué)評(píng)價(jià)方法

采用斜板試驗(yàn)、BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分測(cè)試動(dòng)物肢體運(yùn)動(dòng)情況[6-7]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GAP-43表達(dá)

在術(shù)后7、14、21 d姜黃素治療組GAP-43表達(dá)水平高于生理鹽治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在術(shù)后1、3、7、14、21 d生理鹽水治療組GAP-43表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分結(jié)果

所有動(dòng)物術(shù)前評(píng)分為21分，在術(shù)后3 d假手術(shù)組評(píng)分達(dá)到20分，功能基本恢復(fù)正常。在術(shù)后14 d姜黃素治療組評(píng)分明顯高于生理鹽水治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3 斜板實(shí)驗(yàn)

術(shù)前動(dòng)物斜板實(shí)驗(yàn)角度達(dá)70°～75°，術(shù)后斜板實(shí)驗(yàn)角度至20°，表明造模成功。術(shù)后7、14、21 d姜黃素治療組斜板實(shí)驗(yàn)角度高于生理鹽水治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3 討論

在脊髓損傷后的早期，適度的星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)化可以通過物理和化學(xué)性重建中樞神經(jīng)系統(tǒng)的整體性，關(guān)閉血腦屏障以減少炎癥浸潤(rùn)，使感染和蔓延的細(xì)胞損傷最小化來穩(wěn)定中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織；而后轉(zhuǎn)入繼發(fā)性反應(yīng)期星形膠質(zhì)細(xì)胞由靜止態(tài)轉(zhuǎn)向活化態(tài)，并繼續(xù)進(jìn)入增殖態(tài)，數(shù)目增加、胞體肥大，并遷移到損傷處邊緣，交織成網(wǎng)狀形成膠質(zhì)瘢痕，成為神經(jīng)再生的屏障。GAP-43在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，它可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)椎基底部胞漿膜擴(kuò)張?zhí)帲瑢?duì)突觸的形成與重建具有重要作用，具有促在神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、再生，是神經(jīng)再生的標(biāo)志性蛋白[8-10]。鄒明明等[11]采用姜黃素治療損傷的脊髓，發(fā)現(xiàn)它可以減少神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和硫酸軟骨素蛋白多糖的大量表達(dá)，減輕了星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生，縮小空洞和瘢痕，改善損傷區(qū)域的微環(huán)境，有利于脊髓斷端軸突再生和殘存神經(jīng)細(xì)胞通過瘢痕區(qū)。通過BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，姜黃素組和生理鹽水組動(dòng)物在損傷早期（1～3 d）的肢體運(yùn)動(dòng)能力和控制體位能力變化不明顯，但是到了損傷中晚期（7～21 d）動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況出現(xiàn)明顯改善，且以姜黃素組變化最為明顯，此外GAP-43的表達(dá)水平在術(shù)后14～21 d呈現(xiàn)高水平表達(dá)。這主要是由于脊髓損傷后早期炎癥介質(zhì)大量釋放、神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化程度較低，導(dǎo)致局部微環(huán)境惡劣，神經(jīng)再生修復(fù)能力較弱，但到了脊髓損傷后中晚期由于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被大量激活形成膠質(zhì)瘢痕，限制了炎癥擴(kuò)散，改變了損傷區(qū)域微環(huán)境，有利于細(xì)胞存活，但是也阻礙了神經(jīng)再生修復(fù)[12]，而姜黃素不僅能抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化，阻礙了膠質(zhì)瘢痕的形成，而且通過抗炎、抑制鈣超載、抑制蛋白質(zhì)聚積改善損傷區(qū)域的內(nèi)環(huán)境，啟動(dòng)生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)再生修復(fù)。

總之，姜黃素通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化、抗炎、抑制鈣超載、抑制蛋白質(zhì)聚積，改善脊髓內(nèi)環(huán)境，有利于神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)。

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（收稿日期：2017-08-03）