基于線粒體D-loop DNA序列的甌江口鰻鱺幼苗遺傳鑒定

付秀蘭，謝斐昂，LUSANA James,3，陳永久,，李德偉，蔣日進

(1.國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江舟山 316022；3.Department of Aquatic Science and Fisheries Technology，University of Dar es Salaam，Dar es Salaam 35064，Tanzania；4.浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部重點漁場漁業(yè)資源科學觀測實驗站，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術研究重點實驗室，浙江舟山 316021)

在分類學上,鰻鱺隸屬于硬骨魚綱Osteichthyes、鰻鱺目Anguilliformes、鰻鱺科Anguillidae、鰻鱺屬Anguilla。鰻鱺是一種逆河降海的洄游性魚類，成鰻在海中產(chǎn)卵，卵孵化后隨洋流遷移到江河口附近索餌。日本鰻鱺Anguilla japonica是廣泛分布于日本北海道至菲律賓之間的西太平洋18種鰻魚之一[1]，其神秘的生活史過程，復雜的繁殖生物學特征以及獨特的幼魚形態(tài)特征使人們對其產(chǎn)生濃厚的興趣[2]。日本鰻鱺是一種具有重要經(jīng)濟價值的魚類[3]，特別在東亞是一類很受大眾喜愛的海產(chǎn)品。近年來，由于過度捕撈，棲息地破壞，入?？谖廴荆约皻夂蜃兓热藶橐蛩貙е氯毡决狑~種群數(shù)量從1970年到2003年下降了大約90%，現(xiàn)今形勢還尤為嚴峻[4]。因此，開展相關研究來維持和保護日本鰻鱺種群勢在必行[5]。

甌江口地處東海南部近海，該海域是魚類索餌、產(chǎn)卵、繁育的良好場所，具有豐富的漁業(yè)資源。歷史上，甌江口是鰻苗的主要產(chǎn)地，上世紀70年代以前浙江省年產(chǎn)鰻苗3000多t，占全國產(chǎn)量3成以上[6]。近年以來，由于水利工程建設，環(huán)境污染和過度捕撈等因素，鰻苗資源總體上呈現(xiàn)衰退的趨勢。

為了更好地對漁業(yè)資源進行管理和保護，開展種質(zhì)資源鑒定尤為重要。鰻鱺線粒體DNA控制區(qū)(control region或稱D-loop)具有較高的多態(tài)性，可以有效地揭示鰻鱺屬內(nèi)種間、甚至種內(nèi)群體間的遺傳變異[7-9]。本研究采用線粒體D-loop DNA序列對浙江甌江口鰻鱺幼苗進行遺傳鑒定，以期為漁業(yè)資源管理者及政策制定者提供基礎資料參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究的鰻鱺幼苗樣本于2017年3月從浙江溫州甌江口及鄰近水域采集。采樣地點北至清江河口，南至鰲江河口，西至楠溪江，東至洞頭列島，共包括6個采樣點：楠溪江、清江、鰲江、飛云江、洞頭和甌江，具體采樣地點如圖1所示。樣本采用95%酒精固定后帶回實驗室，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 甌江口玻璃鰻的采樣信息Fig.1 The sampling information of glass eel in the Oujiang River estuary

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

DNA序列分析樣品包括34尾玻璃幼鰻，全長均為55 cm左右。此外，還有1尾成年日本鰻鱺樣本采自于甌江。采用DNeasyR血液和組織試劑盒(Qiagen，Valencia，美國)從鰻魚尾鰭中提取基因組DNA，操作方法按照試劑盒說明。提取的DNA經(jīng)過瓊脂凝膠電泳檢測后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增和DNA測序

用于PCR的正、反向引物分別為L15625-CR 和 H84-CR[8]。PCR 采用 25 μL反應體系，包括 12.5 μL GoTaqRGreen Master Mix(Promega，美國)，正、反向引物(10 μM)各 2 μL，2 μL DNA模版，8.5 μL無菌超純水。PCR程序：95℃預變性2 min，然后95℃變性30 s，52℃退火40 s，72℃延伸90 s，共35個循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。采用1.5%的瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物的濃度和純度，PCR產(chǎn)物檢測陽性后送至上海生工生物技術有限公司，采用ABI-PRISM 3730進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

采用Sequencher 5.4(Gene Codes)和BioEdit V.7.0.4.1[10]軟件將測序結果進行檢查、校正和序列比對。將校正、比對后的序列文件保存為“fas”類型文件。通過BLAST工具(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)將所得的DNA序列在GenBank中進行相似性檢索，得出物種的分類地位。使用DnaSP 5.0軟件[11]計算DNA序列中的多態(tài)位點數(shù)(S)，單倍型多態(tài)性(Hd)、核苷酸多態(tài)性(π)，及單倍型間平均堿基差異數(shù)(k)，進行Tajima’s D 的中性檢驗，并分析核苷酸錯配分布(Mismatch distribution)。采用Arlequin 3.5[12]進行分子方差分析(AMOVA)，并計算采樣點之間的FST值。最后，采用MEGA 6.0[13]計算DNA序列之間的Kimura雙參數(shù)遺傳距離,再構建鄰接(NJ)聚類樹。

2 結果

通過對獲得的800 bp線粒體D-loop DNA序列在Gen-Bank中BLAST比對，發(fā)現(xiàn)所有的序列與日本鰻鱺的D-loop序列相似度最高(＞99%)。34個樣本的D-loop序列分別代表34個不同的單倍型；DNA序列中的多態(tài)位點數(shù)目(S)為74；單倍型多態(tài)性(Hd)為 1.0±0.007；核苷酸多態(tài)性(π)為 0.011±0.000 8；單倍型間平均堿基差異數(shù)(k)為8.67。

6 個采樣點之間的遺傳差異均很小(FST≤0.023；P＞0.05)[11]。楠溪江與洞頭樣本間的FST指數(shù)最大，為0.023，其次為楠溪江與飛云江(FST=0.018)，甌江與飛云江的FST指數(shù)為0.006，其余采樣點間幾乎都沒有遺傳差異(表1)。AMOVA分析結果顯示，種群內(nèi)的分子變異率很高(102%；d.f=5)，而種群間的分子變異率很小(-2.8%；d.f=28)。此外，NJ聚類關系顯示，6個采集點鰻鱺單倍型互相交錯，沒有形成明顯的與地理相關的譜系類群(圖 2)。

圖2 幼鰻D-loop單倍型的NJ聚類樹Fig.2 The NJ tree of D-loop haplotypes of eel larvae

表1 不同采集地點幼鰻樣本的遺傳差異指數(shù)(FST)Tab.1 The genetic differentiation index(FST)of eel among different sampling sites

甌江口日本鰻鱺34個樣本的Tajima’s D中性檢驗顯示，D=-1.982 96(P＜0.01)。此外，核苷酸錯配分布曲線呈單峰狀(unimodal distribution)，如圖3所示。

3 討論

傳統(tǒng)上對鰻鱺苗種鑒定的方法主要是依據(jù)外形和脊椎骨數(shù)量作為分類依據(jù)，但形態(tài)學方法受到發(fā)育階段的限制，因此采用形態(tài)學鑒定鰻鱺苗種的方法存在較多缺陷[14]。最近，利用分子手段鑒定鰻鱺苗種的方法受到廣泛關注和認可，線粒體COI[15]，16S rRNA[16]，以及 RAPD[17]等遺傳標記均能有效地鑒別鰻苗的種類，但基于線粒體D-loop序列鑒定鰻苗的研究尚未見諸多報道。之前，已有一些學者報道花鰻鱺D-loop遺傳變異與系統(tǒng)地理關系[7-9]。本研究首次利用分子方法鑒定甌江口6個采樣點的玻璃幼鰻，并通過GenBank Blast發(fā)現(xiàn)這些幼鰻的種類為日本鰻鱺。甌江口曾經(jīng)是國家二級保護動物花鰻鱺的棲息地之一，近年的資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)該種類已基本絕跡，但仍有日本鰻鱺的蹤跡[18]。本研究與先前研究得出的結論基本一致。

圖3 幼鰻核苷酸錯配分布曲線(預期模型：種群恒定)Fig.3 The nucleotide mismatch distribution curve in the eel larvae(expected null model：constant population size)

單倍型數(shù)目、單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性是基于DNA序列遺傳多樣性研究的幾個重要參數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)甌江口34尾日本鰻鱺分別為34個不同的單倍型。單倍型多態(tài)性(Hd)為1.0，核苷酸多態(tài)性(π)為0.011，這說明該甌江口幼鰻地理群體內(nèi)的遺傳變異水平較高。

各采樣點之間沒有顯著的遺傳差異 (FST≤0.023；P＞0.05)，AMOVA結果顯示種群間的遺傳變異率非常小，這說明甌江口的日本幼鰻未形成地理分化，暗示它們可能隨機地來自于同一個或多個產(chǎn)卵場。

此外，Tajima’s D顯著性的負值(D=-1.982 96，P＜0.01)，表示日本鰻鱺種群在近期歷史上可能曾出現(xiàn)過種群擴張事件。核苷酸錯配分布結果進一步印證了這些日本鰻鱺可能發(fā)生過種群爆發(fā)性擴張。這一發(fā)現(xiàn)與先前的研究報道相吻合[19]，中國東部沿海多數(shù)Hd較高、π較低的魚類，在末次冰期以來都有過一次規(guī)模較大的種群擴張。