大型海洋動物標本霉變菌株的篩選與防治探索

鄭偉偉，何建瑜，唐 益，魏余興，樊英萍，陳 健，劉雪珠

(1.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江舟山 316022；2.Department of Biology，University of Pisa，Pisa 56125，Italy；3.浙江海洋大學海洋生物博物館，浙江舟山 316022)

大型海洋動物干制填充標本是將海洋生物整體或部分組織作為樣品，經過物理或化學手段防腐，使其能夠長久保存，為展示、教學、以及科學研究之用。然而因大型海洋動物標本都為生物有機體，多含有一定量的糖類、脂肪和蛋白質等物質，盡管已做防腐處理，仍易受到霉菌的侵害，發生霉變[1-2]。生物標本的霉變主要發生在其表面[3-4]，不同的霉菌可以產生無性孢子和有性孢子，其生長過程的代謝行為勢必對生物體造成霉腐等劣化行為[5-14]，會嚴重影響到生物標本的觀賞和科研價值。目前，我國各海洋生物標本館的干制填充標本霉變現象非常普遍，但關于霉變的研究報道多數其中于經濟作物[7-10，15]，有關大型海洋動物標本霉變與防治幾乎沒有。本實驗旨在從霉變標本上篩選霉變菌株并鑒定，測試幾種常見市售防霉劑對霉變菌株的抑制效果，為針對性地篩選有效的海洋生物標本防霉劑提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 霉菌的分離純化

采樣時間為2017年梅雨季節間的6月15日，無菌操作于浙江海洋大學海洋生物博物館中的銀杏齒中喙鯨Mesoplodon ginkgodens的右側背鰭基底體側腹部、鯨鯊Rhincodon typus的右側第2鰓裂至第3鰓裂間及侏儒抹香鯨Kogia sima的尾柄左側皮膚表面采集霉變樣本 (采樣部位取決于該部位霉菌生長是否旺盛)，返回實驗室后立即進行無菌分離培養[16]。將霉變樣品接種于已滅菌處理的馬鈴薯固體培養基(PDA)[17]，于28℃恒溫倒置培養3～5 d，挑取單菌落并反復劃線純化菌株。純化后的菌種一部分用于鑒定和抑制實驗，4℃保存；另一部分制成20%甘油菌懸浮液，-20℃保存。

1.2 菌株鑒定

1.2.1 形態學鑒定

利用載玻片觀察培養法，對不同生長階段的霉菌進行高倍鏡鏡檢，觀察分生孢子結構，包括分生孢子頭球、分生孢子梗和菌絲，并拍照記錄[16，18]。根據霉菌菌落特征及菌株的顯微形態初步排除部分重復菌株。

1.2.2 ITS基因鑒定

用真菌DNA提取試劑盒(Fungi Genomic DNA Extraction Kit，Solarbio)提取純化培養菌株的DNA，采用真菌特異性引物 (ITS1：5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇和 ITS4：5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇)進行 PCR 擴增[19-21]，50 μL 反應體系為：10×buffer 5 μL，dNTPs 1 μL，Primer ITS1 1 μL，Primer ITS4 1 μL，ddH2O 35.5 μL，Taq 酶(TaKaRa)0.5 μL，25 mM MgCl25 μL，模板 DNA 1 μL。PCR 擴增條件為：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性 20 s，50～60 ℃退火 20 s，72 ℃ 延伸 20～50 s，循環 35次；最后 72 ℃延伸 5 min。PCR 產物純化后送上海凌恩生物科技有限公司進行DNA序列測定。經GenBank中Blastn序列比對后，用MEGA 5.1中的Neighbor-Joining算法構建系統發育樹，進行系統發育分析，系統樹每個分支的統計學顯著性分析以Bootstrap方法進行檢驗，重復次數為1 000次[22-24]。

1.3 防霉劑稀釋處理

試驗選擇的4種常用的克霉劑，多菌靈、克霉唑、苯甲酸鈉、尼泊金乙酯皆從市場購置。將上述4種不同防霉劑制成安全范圍內(安全濃度范圍指各防霉劑用量低于小白鼠或狗的口服LD50值)不同濃度的系列溶液，即實驗溶液的最大濃度均低于文獻報道的安全濃度[25]。其中多菌靈的最大實驗濃度為700 mg/L(濃度梯度首次設置為200～700 mg/L，間隔為100 mg/L，后補充550 mg/L及650 mg/L)，克霉唑的最大實驗濃度為 15 000 mg/L(濃度梯度分別為 2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 和 15 000 mg/L)，苯甲酸鈉為 800 mg/L(濃度梯度為200～800 mg/L，間隔為100 mg/L)、尼泊金乙酯為15 000 mg/L(濃度梯度設置同克霉唑)。

1.4 防霉劑抑制霉變菌株試驗

將100 μL濃度已知的霉菌孢子懸浮液(1×106±2×105spores/mL)，加入到PDA平板中，涂布均勻，制成菌板。取上述各溶液2.5 μL置于圓形濾紙片(Φ=6 mm)上，制得不同含量的防霉劑濾紙片，濾紙片平貼于上述含菌板中，每種防霉劑每個濃度3次平行試驗，溶劑為空白對照。將貼好濾紙片的平板28℃恒溫倒置培養。每天觀察并用游標卡尺測量抑菌圈直徑[26]。選取抑制效果最優的防霉劑進行最低抑制濃度的測定。

1.5 液體培養法測多菌靈最低抑制濃度

將多菌靈溶液測試濃度配制成0.2～1.6 mg/L共7個梯度，每株菌每個濃度平行3組。每組的配比為：4 mL查氏液體培養基+0.5 mL孢子懸浮液+0.5 mL多菌靈溶液。設空白對照為純培養基與加孢子懸浮液的培養基。最后將上述試驗組與對照組放入搖床140 r/min，28℃恒溫培養，觀察有無霉菌生成[27]。

1.6 數據處理

試驗所得數據用SPSS19.0進行單因子顯著性差異分析(One-Way ANOVA)和t檢驗[28]，以R軟件ggplot程序包做圖。

2 結果與分析

2.1 霉變菌株的篩選與鑒定

經分離和反復劃線純化，獲得8株菌株，再經菌落形態和顯微形態觀察，去除酵母菌，最終得到6株菌株，分別編號為 D1、D2、D3、D4、D5 和 D6。

10倍目鏡下用高40倍物鏡觀察霉菌形態，菌株D1、D2、D3、D5均具有曲霉屬的顯著特征，分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，呈球形；菌株D4、D6具有青霉屬的顯著特征，分枝成帚狀的分生孢子從菌絲體伸向空中。

2.2 霉菌ITS鑒定結果

利用Blastn從GenBank獲取該6株霉菌同源性達99%的相似菌株，對相似菌株的分離源進行分析。經MEGA5.1構建系統發育樹如圖 1所示，D1、D2、D3和D5與曲霉菌屬關系較近，D4和D6與青霉菌屬親緣關系較近。結合顯微形態學觀察結果，6株霉變菌株的鑒定結果與基因登錄號分別為聚多曲霉 A.sydowii D1(MG799216)、日本曲霉 A.japonicas D2(MG799217)、棘孢曲霉 A.aculeatus D3(MG799218)、產黃青霉 Penicillium chrysogenum D4(MG799219)、黃曲霉 A.flavus D5(MG799220)和中文名不詳的青霉菌P.hispanicum D6(MG799221)。其中D1菌株來自銀杏齒中喙鯨的右側背鰭基底體側腹部，D2和D3菌株樣品取自鯨鯊右側第2鰓裂至第3鰓裂間，菌株D4和D5來自鯨鯊眼后部頭上皮膚，D6菌株取自侏儒抹香鯨的尾柄左側皮膚。推測引起不同動物標本的優勢菌種存在一定的差異。

圖1 基于真菌ITS基因序列的系統發育分析Fig.1 Phylogenetic dendrogram of 6 mildews based on the ITS gene

2.3 4種防霉劑對霉變菌株的抑制作用

4種防霉劑對6株霉變菌株的抑制效果及最佳抑制濃度見表1。結果顯示苯甲酸鈉 (最高試驗濃度8 000 mg/L)和尼泊金乙酯(最高試驗濃度15 000 mg/L)在安全范圍內所有濃度對6株霉菌均無抑制作用；克霉唑對6種霉菌的抑制作用程度相近。多菌靈對青霉菌P.chrysogenum D4和P.hispanicum D6的抑制作用最強，對曲霉菌A.sydowii D1、A.japonicas D2、A.aculeatus D3抑制效果相對較弱，對黃曲霉A.flavus D5的抑制作用最弱。

表1 4種防霉劑對6株霉變菌株的最佳抑制濃度及抑制效果Tab.1 Optimum inhibitory concentration and result of 4 antifungal agents effecting on each mildew

2.4 多菌靈對6株霉菌的抑制效果

多菌靈對6株霉菌菌株的抑制作用如圖2所示，在所有濃度中最佳抑制效果如圖3所示。結果顯示，多菌靈對青霉屬的菌株抑制效果優于曲霉屬的菌株(P＜0.05)，所有濃度下均能較強抑制P.chrysogenum D4和P.hispanicum D6(抑菌圈直徑＞20 mm)，最佳抑制濃度均為550 mg/L，抑菌圈直徑分別為45.5±1.7 mm和41.5±1.0 mm，抑制作用無顯著差異(P＞0.05)。多菌靈對曲霉屬菌株的抑制作用則存在較大的差異：在相對低濃度(200～500 mg/L)時，多菌靈對 A.aculeatus D3的抑制作用一直處于最高，其次為A.japonicas D2，對A.flavus D5有微弱的作用，而對A.sydowii D1無抑制作用。從550 mg/L開始，多菌靈對菌株A.sydowii D1產生抑制作用，一直維持到最高濃度，抑制水平與A.japonicas D2和A.aculeatus D3相近，且三者的抑菌圈直徑顯著高于A.flavus D5 (P＜0.05)。雖然所有濃度多菌靈都顯示對A.flavus D5的抑制作用，但作用一直較弱，抑菌圈直徑均小于12 mm。

圖2 多菌靈對6株霉菌的抑制效果Fig.2 The inhibition effect of carbendazim on 6 strains of mildew

圖3 多菌靈最佳抑制濃度下6株霉菌的抑菌圈Fig.3 The inhibitive effect of 6 strains under the optimum inhibitory concentration of carbendazim

2.5 多菌靈對6株致霉菌的最低抑制濃度

多菌靈對A.sydowii D1、A.japonicas D2、A.aculeatus D3、P.hispanicum D6的最低抑制濃度(minimum inhibition concentration，MIC)均為0.2～0.4 mg/L，對D4產黃青霉 P.chrysogenum 的MIC值略高，為 0.4～0.6 mg/L(表2)。方貽文在研究臍橙留樹貯藏技術時發現多菌靈對黑曲霉、黃曲霉、擬青霉、木霉的MIC分別為1.0、1.5、1.5和0.6 mg/L[7]，均比本次實驗從海洋動物標本中所篩選的上述5株霉菌的最低抑制濃度高。然而多菌靈對鑒定為黃曲霉的A.flavus D5菌株的抑制效果較弱，其MIC相對較高為1.6～2.0 mg/L，與上述文獻數值較為一致。

表2 多菌靈對6株霉菌的最低抑制濃度(MIC)Tab.2 The minimum inhibitory concentration(MIC)of carbendazim inhibiting the growth of 6 molds

2.6 克霉唑對6株霉菌的抑制效果

克霉唑對6株霉菌菌株的抑制作用如圖4所示，在所有濃度中最佳抑制效果如圖5所示。結果顯示，與多菌靈比較，克霉唑對霉變菌株的抑制作用沒有明顯的種屬差異性，但在同一濃度下對不同菌株的抑制效果也略顯不同。所有菌株在低濃度時(2 000 mg/L)就有被抑制現象，產生較明顯的抑菌圈，且此濃度下對曲霉菌屬的抑制效果略強(抑菌圈直徑＞30 mm)。進一步分析發現在所有濃度下(2 000～15 000 mg/L)克霉唑對曲霉屬的聚多曲霉 A.sydowii D1、日本曲霉A.japonicas D2和棘孢曲霉 A.aculeatus D3均有較強抑制效果，最強抑制濃度分別為15 000、4 000和4 000 mg/L(抑菌圈直徑分別為38.2±0.6 mm、34.3±2.1 mm和32.7±1.5 mm)。比較奇怪的是除了在濃度為2 000 mg/L時，克霉唑對黃曲霉A.flavus D5的抑制作用略勝于青霉菌P.chrysogenum D4和P.hispanicum D6外，在其余濃度下抑制作用皆為最弱。對青霉菌屬的D4和D6菌株而言，克霉唑能產生較大的抑菌圈(抑菌圈直徑＞20 mm)，產生最大抑菌圈的濃度分別為8 000和6 000 mg/L。

圖4 克霉唑對6株霉變菌株的抑制效果Fig.4 The inhibition effect of clonazole on six molds

圖5 克霉唑最佳抑制濃度下6株霉菌的抑菌圈Fig.5 The inhibitive effect on 6 strains under the optimum inhibitory concentration of clotrimazole

3 討論

國內外對于防霉的研究多數集中于經濟作物、木材及飼料等的儲存及霉菌病的防治上[29-34]，還未見有針對海洋動物標本霉變的防治研究。采用常規分離純化方法，結合形態學觀察及ITS序列分析共獲得6株引起海洋動物霉變的菌株，4株為曲霉菌，2株為青霉菌。聚多曲霉A.sydowii D1和日本曲霉A.japonicas D2在霉變微生物中較為少見[35-36]，棘孢曲霉A.aculeatus D3和青霉菌P.hispanicum D6未見有報道出現在其他材料的霉變樣品中。研究還發現6株菌來源于不同樣品源，引起海洋生物干制標本霉變菌株具有一定的特異性，推測可能與標本質地有關。要全面了解引起海洋生物標本霉變菌，下一步研究需要進行更廣泛的取樣。

分析4種市售防霉劑對各霉變菌株的抑制效果，研究發現只有多菌靈和克霉唑對本實驗的標本霉變菌株有抑制效果。多菌靈對青霉屬的P.chrysogenum D4和P.hispanicum D6抑制效果最佳；對聚多曲霉A.sydowii D1、日本曲霉A.japonicas D2、棘孢曲霉A.aculeatus D3抑制相對弱一些，且聚多曲霉A.sydowii D1對多菌靈的濃度敏感性較強；對黃曲霉A.flavus D5的抑制作用更弱，這可能和多菌靈的抑菌機制有關(多菌靈可與紡錘絲的微管蛋白質相結合從而對有絲分裂進行干擾。但是紡錘絲微管蛋白質的細微改變都可降低多菌靈與微管蛋白質的結合力，因而易引起抗藥性[37]。)，同一濃度對不同菌株的抑制作用存在著顯著差異(P＜0.05)，顯示多菌靈在防霉效果上有一定的物種選擇性。相反，克霉唑對曲霉屬的菌株抑制效果略強于青霉屬的菌株，但差異不大，同一濃度對不同菌株的抑制作用差異也較小，顯示為較廣譜的抑制效果。在相同濃度下兩種防霉劑對常見腐霉菌黃曲霉的抑制作用都較弱，黃曲霉菌是否已經對現有防霉劑產生一定的耐藥性值得進一步研究。市售防霉劑對食品、木材等有作用的化學防霉劑不一定對海洋生物標本防霉有效，不同的防霉劑對同一菌株的抑制效果不同，同種防霉劑對不同霉變菌株的抑制效果也不同，有必要在后續實驗中更廣泛地篩選市售防霉劑。張明輝在研究抑制藍濕革霉菌生長時采用復配防霉劑的防霉性能明顯提高，復配濃度和各自的最低抑菌濃度都有顯著下降[26]。提示除了廣泛篩選防霉劑外，還可進行混合配比研究，以期得到對海洋生物標本霉變菌有更強抑制作用、安全性更好的混合防霉制劑。