星點設計－響應面法優化浸泡型桑葚果酒制作工藝

孫 敏 ，田 野 ，崔高超 ，魏騰飛 ，楊 芳

藥食同源的桑葚因其果肉多汁、色澤艷麗、香氣幽雅、色素含量高且穩定，是釀酒的極佳原料［1］。桑葚中黃酮類化合物具有增強毛細血管強度、抗自由基、抗病毒、抗炎、調節血脂等生物學活性［2－8］。 桑葚水解物含槲皮素－3－O－蕓香苷、槲皮素己糖苷、槲皮素鼠李糖基己糖苷、山奈酚、鼠李糖苷、花青素－3－O－葡萄糖苷和花青素－3－O－蕓香苷具有抑制膳食丙烯酰胺誘導的活性氧過度產生，恢復細胞線粒體膜電位，抑制線粒體膜脂質過氧化和谷胱甘肽的消耗，對抗膳食丙烯酰胺引發的細胞毒性，發揮保護細胞的作用［9］。目前，桑葚果酒的加工方法有浸提法和發酵法。浸提法以桑葚為原料，選擇合適的酒基進行浸泡。乙醇可以將桑葚中許多有益的成分萃取到酒中，這樣不僅將不易存放的桑葚保存，還能將桑葚的保健成分萃取出來。果酒中的總糖、總酸都是決定果酒口感的重要風味物質。有機酸具有抑菌、抗病毒、增加冠動脈流量、抑制腦組織脂質過氧化等作用。

星點設計響應面優化法是一種新型的試驗設計方法。較均勻設計和正交實驗設計，星點設計響應面優化法更能夠靈敏地考察各因素間的交互作用，精確度更高，近些年逐漸被用于食品科學試驗的設計［10，11］。本研究通過星點設計響應面優化法來對浸泡型桑葚果酒制作條件進行設計，選擇料液比、酒基乙醇體積分數、桑葚粉碎時間為自變量，桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分作為因變量，對自變量各因素水平進行多元線性回歸和多項式擬合，通過數學模型進行預測最佳浸泡型桑葚果酒制作工藝參數。

1　材料與方法

1.1　材料

桑葚：大十新鮮桑葚，產自陜西省安康市漢濱區張灘鎮。酒基為市售二鍋頭白酒（60%，V／V）。

1.2　儀器

SP－723型分光光度計 （上海光譜儀器有限公司）、UPT－II超純水機 （四川優普超純科技有限公司）、ALC－210.4型微量分析天平 （德國賽多利斯公司）、Legend Micro17R微量冷凍高速離心機 （美國Thermo公司）、PHS－3C pH計 （上海儀電科學儀器股份有限公司）。

1.3　藥品與試劑

30～60目聚酰胺、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化銨、無水葡萄糖標準品、石油醚、無水硫酸鈉、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、乙醇、乙酸均為分析純，甲醇、槲皮素標準品均為色譜純。

1.4　方法

1.4.1浸泡型桑葚果酒總糖含量的測定 采用3，5－二硝基水楊酸法（DNS 法）測定［12］。 取一定量的待測桑葚果酒樣品，裝入離心管中，以3 000 r／min的轉速離心5 min，取0.5 mL放入100 mL的三角瓶中，加入 7.5 mL的去離子水和 5 mL 6 mol／L的HC l，置于68℃水浴中加熱水解15 min。待其冷卻后，用6 mol／L的NaOH中和多余的酸。用去離子水將其定容到25 mL的容量瓶中混勻，即得待測液。

葡萄糖標準溶液配制（1.0 mg／mL）：在分析天平上準確稱取0.100 0 g分析純葡萄糖（預先在105℃干燥至恒重），溶于去離子水中。依次移取0、0.2、0.4、0.8、1.2 mL 標準葡萄糖工作液、2.0 mL 去離子水于6個5 mL比色管中，加去離子水補足至2 mL，再在每個容量瓶中加入1.5 mL顯色劑DNS，搖勻后將6個容量瓶放在沸水浴中加熱5 min，立即冷卻。用去離子水定容至25 mL，搖勻。以去離子水顯色反應液做空白調零，用1 cm比色皿在540 nm處測其吸光度，繪制標準工作曲線。

總糖的測定：取20支25 mL的刻度試管編號，每管移取1 mL浸泡型桑椹果酒多糖的待測液、加去離子水補足至2 mL，再在每個容量瓶中加入1.5 mL顯色劑DNS。加熱、定容和比色等其余操作與制作標準曲線的方法相同。

總糖含量（g／L）＝查曲線所得水解后的還原糖（g／L）×稀釋倍數（100×25）×0.9

1.4.2浸泡型桑葚果酒總酸含量的測定 用鄰苯二甲酸氫鉀作基準物質標定NaOH溶液。桑葚果酒12 000 r／min離心10 min后，移取上清液2 mL至離心管。用氫氧化鈉標準溶液進行滴定，利用pH計來調節終點電位與預控電位。滴定終點電位是8.3［13］。記錄此時消耗的氫氧化鈉的體積。按下列公式計算桑葚果酒總酸含量：總酸含量（g／L）＝C×Vk×V1／V2，其中，C 為氫氧化鈉標準溶液濃度（g／mL），Vk為檸檬酸系數［14］，V1為氫氧化鈉標準溶液消耗體積（mL），V2為桑葚果酒上清液取樣體積（L）。

1.4.3浸泡型桑葚果酒總黃酮的測定 采用聚酰胺吸附－硝酸鋁顯色法測定［15］。聚酰胺預處理：用90%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去起泡后裝柱。用3倍體積的90%乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘渣。依次用2倍體積5%氫氧化鈉溶液、1倍體積的去離子水、2倍體積10%乙酸水溶液洗脫，最后用去離子水洗脫至pH中性，備用。

標準曲線的建立：準確稱取干燥的槲皮素標準品［16］10.60 mg 于 25 mL 容量瓶中，用 70%甲醇溶解，定容至刻度，得到濃度為424.0μg／mL的槲皮素標準溶液。 分別準確吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL槲皮素標準溶液于10 mL具塞試管中，用30%乙醇定容至5 mL，然后向每管中分別加入0.3 mL 5%NaNO2，搖勻后靜置 5 min，分別加入 0.3 mL 10%Al（NO3）3，搖勻后靜置 6 min，再分別加入 2 mL 1 mol／L NaOH，用30%乙醇定容至刻度，搖勻后靜置20 min，于510 nm處測定吸光度，以空白試劑為參比。

將顆粒狀聚酰胺混懸于水中，使其充分膨脹，然后裝柱20 mL。準確吸取1.0 mL桑椹果酒樣品，經3 500 r／min離心10 min加入30～60目的聚酰胺層析柱中。用30 mL 70%甲醇洗脫，流速72滴／min，從甲醇溶液滴入水溶液中之后開始收集洗脫液，得到1.5 mL洗脫液。準確吸取4.0 mL洗脫液按標準曲線制作方法進行反應，顯色測定。為扣除底色的影響，取 4.0 mL 洗脫液用 30%乙醇稀釋至 10.0 mL，作為參比。

1.5　響應面設計

在前期預試驗基礎上，采用響應面法（RSM）對影響浸泡型桑葚果酒制作的主要因素料液比（V／V，下同）、乙醇體積分數（%）和粉碎時間（min）3個因素為響應因素進行優化。每個因素設計5個水平，分別用代碼-α、-1、0、1、α（α＝1.682）表示，設計因素與水平見表1。以浸泡型桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分為響應值進行試驗安排。

表1　星點設計的因素與水平

1.6　浸泡型桑葚果酒感官綜合評價

浸泡型桑葚果酒制備完成，從果酒的色澤、香氣、滋味、風格4個方面對桑葚果酒進行評分，評分標準見表2。

2　結果與分析

2.1　葡萄糖的測定線性關系考察

葡萄糖標準液的濃度為1 mg／mL，以標準液的濃度 0、0.008、0.016、0.024、0.032、0.04、0.048 mg／mL為橫坐標，以其對應的吸光度（OD值）為縱坐標，繪制標準曲線，得直線回歸方程為 Y＝14.179X－0.000 7（R2＝0.994 4），表明在線性范圍內線性關系良好。

表2　浸泡型桑葚果酒感官評定標準

2.2　槲皮素的測定線性關系考察

槲皮素標準品濃度為424.0μg／mL，以標準品的濃度 0、8.48、16.96、25.44、33.92、42.40、50.88、59.36 mg／L為橫坐標，以其對應的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線， 得直線回歸方程為 Y＝0.007 2X－0.002 3（R2＝0.999 7），表明在線性范圍內（8.48～59.36 mg／L）線性關系良好。

2.3　星點設計試驗結果及響應面分析

依據星點設計－響應面法試驗方案進行3因素5水平試驗，星點設計試驗安排與桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分4個響應值結果見表3。

表3　星點設計試驗結果

2.4　模型擬合及工藝優化

以浸泡型桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分分別為因變量，使用Design－Expert軟件采用二次多項式非線性模型對各影響因素和指標進行回歸計算，其方程如下：

2.5　響應曲面與等高線

采用Design expert 7軟件繪制二次多項式模型中X1、X2、X3中任意2因素對各評價指標的三維效應曲面（其余自變量設為中心點值），見圖1至圖4。通過響應面三維圖，可直觀地反映各因素的交互作用對響應值的影響，有助于確定最佳浸泡工藝參數范圍。

圖1　粉碎時間和料液比對浸泡型桑葚果酒總糖影響的三維曲面和等高線

圖3　粉碎時間和乙醇體積分數對浸泡型桑葚果酒總黃酮影響的三維曲面和等高線

2.6　驗證試驗

經Design expert 7軟件處理后得到的最佳條件為料液比為 59.70∶100，乙醇體積分數為 50.85%，粉碎時間為0.89 min。在此條件下進行驗證試驗，浸泡型桑葚果酒共3份，按照“1.4”各項方法進行試驗，結果見表4。根據優化浸泡工藝參數，平行制備3份樣品，所得浸泡型桑葚果酒各指標實測值與理論預測值接近，表明建立的回歸方程預測性良好。

表4　優化浸泡制作工藝驗證結果

圖2　乙醇體積分數和粉碎時間對浸泡型桑葚果酒總酸影響的三維曲面和等高線

圖4　乙醇體積分數和料液比對浸泡型桑葚果酒感官綜合評分影響的三維曲面和等高線

3　小結

選擇料液比、乙醇體積分數、粉碎時間為自變量，浸泡型桑葚果酒總糖、總酸、總黃酮、感官綜合評分作為因變量，對自變量各因素水平進行多元線性回歸和多項式擬合。通過星點設計－響應面法優化浸泡型桑椹果酒制作工藝，得到的最佳浸泡制作工藝參數為料液比 59.70∶100，乙醇體積分數 50.85%，粉碎時間0.89 min。浸泡型桑葚果酒預測值分別為總糖 28.00 g／L、總酸 1.82 g／L、總黃酮 101.76 mg／L、感官綜合評分90.00。在此條件下進行驗證試驗，浸泡桑葚果酒共3份，各項指標實測值分別為總糖27.27 g／L、總酸 1.87 g／L、總黃酮 99.92 mg／L、感官綜合評分88.00分。實測值與模型預測值間的偏離率分別為－2.6%、2.7%、－1.8%、－2.2%。根據優化浸泡制作工藝參數，平行制備3份樣品，所得浸泡型桑葚果酒各指標實測值與理論預測值接近，表明建立的回歸方程預測性良好。

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