2型糖尿病患者壓瘡局部ATP酶活性及凋亡相關蛋白表達的研究

李崢璟, 柏素萍, 黃佳敏, 孫 輝, 周筱琴

(江蘇大學附屬醫院 燒傷整形科, 江蘇 鎮江, 212001)

糖尿病患者發生壓瘡后，創面遷延不愈，形成慢性難愈性潰瘍，嚴重危害患者的健康[1-2]。近年來，能量代謝和細胞凋亡機制在皮膚創傷與愈合，慢性潰瘍形成與修復領域的機制研究逐步得到重視[3-4]。本研究取2型糖尿病患者Ⅱ期壓瘡、Ⅳ期壓瘡傷口周圍皮膚組織，以健康志愿者為對照，檢測其三磷酸腺苷酶(ATPase)活性、凋亡相關蛋白表達，探討糖尿病患者壓瘡形成過程中可能的作用機制，為糖尿病慢性傷口的防治提供理論依據，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

按2007年美國國家壓瘡協會最新壓瘡分期標準，取材標本來源于Ⅲ期和Ⅳ期壓瘡。Ⅲ期壓瘡: 全層傷口，失去全層皮膚組織，除了骨、肌腱或肌肉尚未暴露外，可見皮下組織，有壞死組織脫落，但組織壞死的深度不太明確，可能有潛行或竇道。Ⅳ期壓瘡: 全層傷口，失去全層皮膚組織，伴骨、肌腱或肌肉外露，局部可出現壞死組織脫落或焦痂，通常有潛行和竇道。選取2013年1月—2015年1月住院的2型糖尿病合并壓瘡患者43例，男20例，女23例。根據2007年美國國家壓瘡協會最新壓瘡分期標準，分為Ⅲ期壓瘡21例, Ⅳ期壓瘡22例，平均年齡(62.3±10.6)歲，全部符合2010年美國糖尿病協會糖尿病診斷標準。排除近1個月內使用可能影響ATP酶藥物的患者(洋地黃類、鈣離子拮抗劑等)，患者換藥時取創口周圍皮膚組織標本。另擇20例健康志愿者(包皮環切患者)作為對照組。

1.2 試劑與儀器

ATP酶活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Trizol、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，兔抗人Bcl-2和Bax單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標記二抗、內參及BCA蛋白定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。實時熒光定量PCR儀為美國Agilent公司，圖像分析系統為Bio-Rad公司(美國)GS-710, 高速低溫臺式離心機為飛鴿公司TGL-16 G。

1.3 方法

1.3.1 ATPase活性檢測: 分組同上，取各組標本，加入生理鹽水制成勻漿液，離心取上清, BCA法測定上清液中蛋白濃度，按照ATPase活性測定試劑盒說明，用分光光度計在波長636 nm處測定吸光度值，根據各樣品蛋白含量計算ATPase活性。

1.3.2 逆轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR): 分組同上，取各組樣本于Trizol試劑中勻漿，并提取各組標本總RNA。使用Thermo逆轉錄試劑盒對提取的總RNA逆轉錄，使用Thermo Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix對Bcl-2、Bax進行PCR擴增，引物分別為Bcl-2: sense, 5′-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3′, antisense, 5′-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTC C-3′; Bax: sense, 5′-ATGGACGGGTCCGGGGAGCAGCCC-3′, antisense, 5′-GGTGAGCACTCCCGCCACAAAGAT-3′,以管家基因GAPDH: sense, 5′-CACCCCATTTGATGTTAGTG, antisense, 5′-CCATTTGCAGTGGCAAAG-3′作為內參，反應結束后確認擴增曲線和溶解曲線，結果用2-ΔΔCT法表示。

1.3.3 蛋白印跡法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達: 分組同上，取各組標本，加入RIPA緩沖液及蛋白酶抑制劑后勻漿, 8 000 g離心10 min收集上清, BCA法測定上清液中蛋白濃度。每個樣品取20 μg蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。待電泳結束后轉膜并依此加入相應一抗: 兔抗人Bcl-2、Bax, 稀釋濃度為1∶200; 二抗: 稀釋濃度為1∶2 500; ECL試劑。使用IPP顯微圖像分析軟件半定量分析得出積分吸光度值，最終得出蛋白表達量。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 ATPase活性，Bcl-2、Bax mRNA表達

ATPase活性檢測結果顯示，與對照組相比，糖尿病患者Ⅲ期壓瘡創緣皮膚ATPase活性減低，差異具有統計學意義(P<0.05); 糖尿病患者Ⅳ期壓瘡創緣皮膚ATPase活性減低明顯，差異具有統計學意義(P<0.05)。RT-qPCR結果顯示，與對照組相比，糖尿病患者Ⅲ期壓瘡創緣皮膚Bcl-2 mRNA表達降低，糖尿病患者Ⅳ期壓瘡創緣皮膚Bcl-2 mRNA表達下降更為明顯; 糖尿病患者Ⅲ期壓瘡創緣皮膚Bax mRNA表達增高，糖尿病患者Ⅳ期壓瘡創緣皮膚Bax-2 mRNA增高更為明顯。見表1。

2.2 Bcl-2、Bax蛋白表達

蛋白印跡法檢測結果顯示, Bcl-2、Bax蛋白表達與Bcl-2、Bax mRNA表達一致，與對照組相比，糖尿病患者Ⅲ期壓瘡創緣皮膚Bcl-2蛋白表達降低，而糖尿病患者Ⅳ期壓瘡創緣皮膚Bcl-2表達降低更為明顯。與之相反，糖尿病患者Ⅲ期壓瘡創緣皮膚Bax蛋白表達水平低，而隨著病程加重, Bax蛋白表達水平增高。見表2。

表1 各組ATPase活性、Bcl-2、Bax mRNA表達結果

與對照組比較, *P<0.05; 與糖尿病Ⅲ期壓瘡組比較, #P<0.05。

表2 各組Bcl-2、Bax蛋白表達

與對照組比較, *P<0.05。

3 討 論

糖尿病發病機制復雜，病情遷延不愈，常導致腎臟、心臟、眼部等多器官的并發癥，且難以逆轉[5]。糖尿病慢性壓瘡是糖尿病患者常見的并發癥，與非糖尿病患者相比，創面更易感染，形成慢性難愈性潰瘍難以治愈，嚴重危害糖尿病患者的健康，降低生活質量，給家庭和社會帶來了經濟壓力和負擔[6-7]。本研究選取2型糖尿病合并壓瘡患者Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡創緣皮膚組織，觀察其ATPase活性、凋亡相關蛋白表達，研究能量代謝與細胞凋亡在糖尿病慢性壓瘡傷口形成過程中可能的作用機制，為糖尿病慢性潰瘍的防治提供理論依據。

健康人皮膚組織結構及功能正常，代謝旺盛，具有調節體溫、排泄廢物及免疫等功能。2型糖尿病患者由于胰島素不足或胰島素抵抗[8], 長期高糖環境刺激，皮膚細胞糖代謝受損，影響細胞正常的增殖、分裂，使得皮膚的修復功能受損[9]。ATPase能將ATP催化水解為ADP并釋放大量能量，維持細胞正常代謝, ATPase活性降低將嚴重影響細胞正常生理功能[10]。研究結果發現，與健康人相比，糖尿病患者Ⅲ期壓瘡創緣皮膚ATPase活性顯著降低，隨著病情遷移，糖尿病患者Ⅳ期壓瘡創緣皮膚ATPase活性降低更為明顯，表明皮膚ATP利用率降低，組織能量代謝受到抑制[11]。ATPase活性的下降導致皮膚細胞增殖分裂、離子交換、物質代謝等過程所需要的能量供應不足，細胞活力下降，影響創面修復[12]。

細胞凋亡是一系列基因、蛋白相互作用參與調控的細胞主動死亡的過程[13]。其中Bcl-2、Bax是凋亡啟動途徑中關鍵的信號分子, Bcl-2和Bax通過形成同源或異源二聚體形式調控細胞凋亡，當Bcl-2/Bax比例增高時，抑制細胞凋亡; 反之，當Bcl-2/Bax比例降低時，促進細胞凋亡[14]。本研究結果發現隨著糖尿病患者壓瘡病情的加重，創緣Bcl-2/Bax mRNA及蛋白表達比例均降低，且趨勢一致，表明組織細胞凋亡增強，凋亡的修復能力、抗感染能力均不同程度受到抑制，導致傷口感染加重、遷延不愈[15-17]。

與非糖尿病患者壓瘡相比，糖尿病患者壓瘡的發病機制復雜，病程遷延不愈，且預后較差，通過控糖、換藥、負壓、照射、抗感染等常規治療往往療效并不明顯[18-19]。本研究結果表明，糖尿病期皮膚組織能量代謝受損和細胞凋亡增強可能是導致糖尿病患者創面病情加重的重要因素，其相互作用關系及具體調控機制仍有待進一步研究。

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