非甲醇誘導重組畢赤酵母表達木聚糖酶的條件優(yōu)化

藍娜娜，張薷月，蘇然，楊倩, 張建國

(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，食品科學與工程研究所，上海，200093)

木聚糖酶是一種廣泛用于食品、飼料、造紙工業(yè)的酶。它的作用為降解木聚糖產(chǎn)生更小分子的木聚糖，甚至單分子木糖[1]。微生物來源的木聚糖酶約占總木聚糖來源種類的80%。為了生產(chǎn)更多的木聚糖酶，木聚糖酶基因在細菌、酵母、真菌和植物中都得到成功表達[2-3]。畢赤酵母(Komagataellaphaffii)是一種較為理想的外源蛋白表達宿主[4]，它以甲醇為唯一碳源而生長。甲醇誘導的醇氧化酶啟動子AOX1能大量表達醇氧化酶。畢赤酵母作為真核表達宿主的優(yōu)點可以總結(jié)如下：(1)具有醇氧化酶AOX1基因啟動子，這是目前最強，調(diào)控機理最嚴格的啟動子之一；(2)表達效率高,其表達的外源蛋白可占總表達蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分離純化；(3)類似于細菌表達系統(tǒng)，酵母的生長是快速和便宜的，而且酵母細胞是真核生物，因此它們具有翻譯后修飾的機制；(4)表達質(zhì)粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合；(5)由于該酵母可以以甲醇為唯一碳源和能源,而絕大多數(shù)微生物并不能以甲醇為碳源,可以減少污染。所以畢赤酵母的AOX1表達系統(tǒng)被廣泛用來表達外源蛋白[5]。多年來，畢赤酵母已被學術(shù)界和工業(yè)界證明能表達各種外源蛋白[6]，由于畢赤酵母來源的外源蛋白的安全性較好，目前已經(jīng)有多種畢赤酵母表達的外源蛋白被批準進入市場[7]。目前畢赤酵母利用AOX1啟動子表達外源蛋白的誘導物仍采用甲醇。為了避免殘留甘油對AOX1啟動子的抑制，誘導過程中需要將培養(yǎng)基從甘油培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變?yōu)榧状寂囵B(yǎng)基，所以畢赤酵母的外源蛋白誘導步驟仍然較繁瑣。另外，由于工業(yè)上使用甲醇的危險性和毒性，很多學者擬通過改造AOX1啟動子實現(xiàn)非甲醇誘導物誘導畢赤酵母表達外源蛋白[8]。發(fā)現(xiàn)其他非甲醇誘導的啟動子也是目前的一個選擇。目前報道的非甲醇誘導的啟動子有甘油誘導的3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(PGAP)[9]、鳥苷三磷酸酶分泌相關(guān)聯(lián)的啟動子(PYPT1)[10]、二強丙酮合成酶啟動子(PDHAS)[11]、甲醛脫氫酶啟動子(FLD1)[12]、乙醇誘導的異檸檬酸裂解酶啟動子(PICL1)[13]、轉(zhuǎn)錄延長因子1-α啟動子(PTEF1)[14]、3-磷酸甘油酸激酶啟動子(PPGK1)[15]。但是這些非甲醇誘導啟動子的表達強度都沒有達到AOX1的表達強度，造成外源蛋白表達量不高。所以AOX1啟動子仍是畢赤酵母表達外源蛋白的主要啟動子。本研究的非甲醇誘導劑從甲基類水溶性無機物考慮，以甲酸銨誘導畢赤酵母AOX1啟動子表達外源蛋白，探討非甲醇誘導劑誘導畢赤酵母高效表達外源蛋白的途徑。

1　材料和方法

1.1　菌株和試劑

表達木聚糖酶的重組畢赤酵母菌株由本實驗室構(gòu)建。酵母粉和蛋白胨購自英國OXOID公司。木聚糖購自上海源葉生物科技有限公司。其他化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

精密恒溫培養(yǎng)箱(BPH-G082型)，上海一恒科學儀器有限公司；單人凈化工作臺(SW-CJ-1D型)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌(LDZX-50KBS型)，上海申安醫(yī)療器械廠；電子天平(PL2002型)，梅特勒-托利多儀器有限公司；pH計(PB-10型)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；可見分光光度計(722S)，上海精密科學儀器有限公司；低速大容量多管離心機(飛鴿LXJ-IIB)，上海安亭科學儀器廠；、小型高速離心機，德國eppendorf公司；多功能酶標儀,美谷分子儀器有限公司。

1.2　培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基：酵母粉10.0 g、蛋白胨20.0 g、葡萄糖20.0 g(固體另加瓊脂粉20.0 g)，加水定容至1.0 L,115 ℃滅菌20 min。

BMGY培養(yǎng)基：溶解10.0 g酵母粉、20.0 g蛋白胨于700 mL水中，高壓滅菌20 min，冷至室溫，加入下列混合液：100 mL 1.0 mol/L PBS緩沖液pH 6.0、100mL 13.4%YNB、100 mL 10%甘油、2 mL 4×10-4g/L生物素,加水定容至1.0 L。

BMMY培養(yǎng)基：溶解10.0 g酵母粉、20.0 g蛋白胨于700 mL水中，高壓滅菌20 min，冷至室溫，加入下列混合液：100 mL 1.0 mol/L磷酸鉀緩沖液pH 6.0，100 mL 13.4%YNB，100 mL 5 %甲醇，2 mL 4×10-4g/L生物素,加水定容至1.0 L。

3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液：取3,5-二硝基水楊酸3.15 g于250 mL水中，45 ℃溶解后加入NaOH 10.48 g，不停攪拌后加入酒石酸鉀鈉92.5 g，溶解后加入苯酚2.5 g，溶解后加入Na2SO42.5 g，攪拌待全部溶解后定容至500 mL。

PBS緩沖液：稱取NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.63g, KH2PO40.24g，溶于900 mL雙蒸水中，用HCl調(diào)pH值至6.0，加水定容至1.0 L，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3　甲醇誘導重組畢赤酵母表達木聚糖酶的條件優(yōu)化

將重組畢赤酵母轉(zhuǎn)接至5 mL YPD,在30 ℃、200 r/min條件下活化至OD600達到1.3～1.5之間，按4%接種量接入100 mL BMGY培養(yǎng)基中，24 h后離心，沉淀轉(zhuǎn)入100 mL BMMY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。本研究中優(yōu)化了甲醇誘導過程中的溫度、pH、甲醇添加量3個條件。在沒有特別說明的情況下默認條件為30 ℃，1%甲醇添加量,pH 6.0。其中設(shè)置溫度為26、28、30、32 ℃，pH設(shè)置為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，甲醇添加量的梯度設(shè)置為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%。

1.4　甲醇和山梨醇聯(lián)合誘導重組畢赤酵母表達木聚糖酶

重組畢赤酵母的培養(yǎng)過程為將重組畢赤酵母轉(zhuǎn)接至5 mL YPD，在30 ℃、200 r/min條件下活化至OD600達到1.3～1.5之間，按4%接種量接入100 mL BMGY培養(yǎng)基中，24 h后離心，沉淀轉(zhuǎn)入100 mL BMMY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，然后每天添加1.0%甲醇不同量的山梨醇。山梨醇的添加量設(shè)置為0.02%、0.05%、0.08%、0.11%、0.14%。

1.5　甲酸銨誘導重組畢赤酵母表達木聚糖酶

重組畢赤酵母的培養(yǎng)過程為將重組畢赤酵母轉(zhuǎn)接至5 mL YPD，在30 ℃、200 r/min條件下活化至OD600達到1.3～1.5之間，按4%接種量接入100 mL BMGY培養(yǎng)基中，24 h后離心，沉淀轉(zhuǎn)入100 mL BMMY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。甲酸銨單獨誘導時甲酸銨添加量梯度設(shè)置為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、5.0%。在甲酸銨和山梨醇聯(lián)合誘導時，采用最優(yōu)甲酸銨添加條件下，同時添加山梨醇(0.1%、0.5%、1%)。在甲醇和甲酸銨聯(lián)合誘導時采用每天添加1.0%甲醇和甲酸銨(0.5%、1%、1.5%、2.0%、5.0%)。

1.6　細胞濃度的測定

將細胞樣品經(jīng)過適當稀釋后在600 nm下測定吸光度值，計算細胞濃度。

1.7　木聚糖酶活力的測定

以4 ℃、12 000g離心發(fā)酵液10 min上清即粗酶液。取20 μL粗酶液加入到1 mL含有10 g/L木聚糖的pH 5.0檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中。50 ℃保溫5 min后加入2 mL DNS溶液煮沸10 min，然后冷卻至室溫，用酶標儀在540 nm測定吸光度。木聚糖酶酶活的定義為:每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol木糖的木聚糖酶活力為1個活力單位。

2　結(jié)果與分析

2.1　誘導溫度對重組畢赤酵母生長和表達木聚糖酶的影響

在誘導溫度為26～30 ℃范圍內(nèi)，重組畢赤酵母的生長和表達木聚糖酶活力的情況分別見圖1-a和圖1-b。重組畢赤酵母在這4個溫度梯度下隨著時間的延長，細胞濃度不斷升高，并在誘導96 h時達到最高值。然后細胞濃度開始下降。相同培養(yǎng)時間時，重組畢赤酵母在30 ℃的條件下有較高的細胞濃度。重組畢赤酵母在30 ℃誘導96 h后達到最高的細胞濃度為20.4 OD600。重組畢赤酵母表達的木聚糖酶活力隨著誘導時間的延長顯著升高，在誘導96 h時均達到最高值，然后酶活力下降?？傮w上看，不同誘導溫度下的木聚糖酶活力差別不顯著。重組畢赤酵母在30 ℃條件下誘導96 h后達到最高木聚糖活力(1 410.2 U/mL)。

圖1　誘導溫度對重組畢赤酵母生長和表達木聚糖酶的影響Fig.1　Effects of temperature on the recombinant K. phaffiigrowth and xylanase activity

2.2　pH對重組畢赤酵母生長和表達木聚糖酶的影響

pH對重組畢赤酵母的生長和表達木聚糖酶的影響見圖2-a和圖2-b。在誘導24 h內(nèi)，不同pH條件下的細胞濃度差別不明顯。隨著誘導時間的延長，pH 5.0條件下的重組畢赤酵母細胞濃度保持穩(wěn)定，并在誘導120 h后出現(xiàn)下降。其他pH條件下重組畢赤酵母細胞濃度不斷升高，并在誘導96 h時達到最高的細胞濃度。重組畢赤酵母在pH 5.5條件下誘導96 h時達到最高值(27.6 OD600)。重組畢赤酵母表達的木聚糖酶活力隨著誘導時間的延長不斷升高，并在96 h時達到最高的木聚糖酶活力。然后木聚糖酶活力保持穩(wěn)定。在pH 5.5的條件下，木聚糖酶活力達到的最高值為2 602.8 U/mL。

圖2　誘導pH對重組畢赤酵母生長和表達木聚糖酶的影響Fig.2　Effects of pH on the recombinant K. phaffiigrowth and xylanase activity

2.3　甲醇添加量對重組畢赤酵母生長和表達木聚糖酶的影響

甲醇添加量對重組畢赤酵母的生長和表達木聚糖酶活力的影響見圖3-a和圖3-b。

圖3　甲醇添加量對重組畢赤酵母生長和表達木聚糖酶的影響Fig.3　Effects of methanol added on the recombinantK. phaffii growth and xylanase activity

重組畢赤酵母的細胞濃度隨著誘導時間的延長不斷升高，并在誘導96 h時達到最高值，然后細胞濃度逐漸下降。在1.0%甲醇誘導96 h的條件下，重組畢赤酵母的細胞濃度達到最高值為34.9 OD600。木聚糖酶活力也在1.0%甲醇誘導96 h時達到最高值(3 403.8 U/mL)，然后木聚糖酶活力出現(xiàn)下降。

2.4　甲醇和山梨醇聯(lián)合誘導對重組畢赤酵母生長和表達木聚糖酶的影響

山梨醇是一種畢赤酵母AOX1啟動子的非抑制性碳源。山梨醇的添加可以為細胞提供額外的能量，提高細胞的生長和外源蛋白的產(chǎn)量[16]。甲醇和山梨醇聯(lián)合誘導培養(yǎng)能夠使畢赤酵母保持誘導強度的同時提供充足的能量。重組畢赤酵母的細胞濃度在誘導48 h內(nèi)顯著升高到22～30 OD600，然后逐漸下降。在不同山梨醇的添加量的條件下，重組畢赤酵母細胞濃度在添加0.05%山梨醇的條件下有最高值32.2 OD600。木聚糖酶活力也隨著誘導時間延長而不斷升高。但是不同山梨醇添加量的條件下木聚糖酶活力差別不明顯。木聚糖酶在誘導120 h時達到最高值(2 615.3 U/mL)。甲醇和山梨醇聯(lián)合誘導培養(yǎng)在120 h達到最高點，而其中山梨醇添加量為0.08%時，在120 h得到最大酶活2 615.3 U/mL。相比于甲醇添加量為1%時在96 h處達到的最大酶活3 403.8 U/mL，為甲醇誘導時木聚糖酶活力的76.8 %。

圖4　甲醇/山梨醇聯(lián)合誘導對重組畢赤酵母生長和表達木聚糖酶的影響Fig.4　Effects of methanol and sorbitol on recombinantK. phaffii growth and xylanase activity

2.5　甲酸銨誘導重組畢赤酵母表達木聚糖酶

在甲酸銨添加量為0.5%～5.0%的范圍內(nèi)，重組畢赤酵母細胞濃度逐漸升高，在誘導48 h后達到穩(wěn)定。重組畢赤酵母在0.5%甲酸銨的條件下有最高的細胞濃度。甲酸銨添加量升高到2.0%時對重組畢赤酵母細胞的生長有微弱的抑制作用。甲酸銨在5.0%添加量對重組畢赤酵母生長有明顯的抑制作用。木聚糖酶活力在初始誘導24 h升高明顯(約1 000 U/mL)，然后出現(xiàn)微弱下降。不同甲酸銨添加量對重組畢赤酵母表達木聚糖酶的影響差別不顯著(圖5)。

圖5　甲酸銨添加量對重組畢赤酵母生長和表達木聚糖酶的影響Fig.5　Effects of ammonium formate added on therecombinantK. phaffii growth and xylanase activity

在甲酸銨誘導的條件下，測定了0～144 h內(nèi)重組畢赤酵母的AOX活力(圖6)。在1.0%甲酸銨的條件下，誘導24 h時的AOX活力最高為6.3 U/mL，在24～144 h內(nèi)，甲酸銨誘導下的AOX活力呈現(xiàn)逐漸下降，在誘導144 h后AOX活力降低到2.7 U/mL。這與甲酸銨誘導下重組畢赤酵母表達木聚糖酶的活力在24～144 h下降的結(jié)果一致。

圖6　甲酸銨誘導下AOX活力的變化Fig.6　AOX activity of recombinant K. phaffiiinduced by ammonium Formate

2.6　甲酸銨和山梨醇聯(lián)合誘導對重組畢赤酵母生長和表達木聚糖酶的影響

重組畢赤酵母在甲酸銨和山梨醇混合添加的條件下生長至48 h，達到最高值，然后保持穩(wěn)定。木聚糖酶活力在甲酸銨和山梨醇聯(lián)合誘導時活力隨著時間的延長顯著升高。木聚糖酶在誘導72 h后達到最高活力(2 032.0 U/mL)，然后出現(xiàn)微弱下降(圖7)。

圖7　甲酸銨/山梨醇聯(lián)合誘導對重組畢赤酵母生長和表達木聚糖酶的影響Fig.7　Effects of combined ammonium formate and sorbitolon recombinant K. phaffii growth and xylanase activity

2.7　甲醇和甲酸銨聯(lián)合誘導對重組畢赤酵母生長和表達木聚糖酶的影響

重組畢赤酵母在每天1%甲醇和不同量的甲酸銨的條件下繼續(xù)生長至誘導到48 h，然后細胞濃度保持穩(wěn)定。在添加0.5%甲酸銨時的細胞濃度約為15 OD600，顯著低于其他甲酸銨添加量組別的細胞濃度。甲酸銨添加1.0%及以上時，細胞濃度穩(wěn)定在約20 OD600。木聚糖酶活力隨著誘導時間的延長顯著升高。誘導72 h后，在所有甲酸銨添加的組別中木聚糖酶活力都達到最高值，然后明顯下降。木聚糖酶活力在甲酸銨添加量為1.5%的條件下有最高活力(3 589.2 U/mL)(圖8)。

圖8　甲醇/甲酸銨聯(lián)合誘導對重組畢赤酵母生長和表達木聚糖酶的影響Fig.8　Effects of combined methanol and ammoniumformate on recombinant K. phaffii growth and xylanase activity

3　討論

畢赤酵母作為外源蛋白表達的宿主已經(jīng)廣泛應(yīng)用到多種重組蛋白的表達。而且，大約有70多種來自畢赤酵母的重組蛋白被推向市場。但是完善畢赤酵母表達系統(tǒng)的工作仍在繼續(xù)。一個重要的研究熱點就是非甲醇誘導劑的開發(fā)。目前開發(fā)非甲醇誘導的方式主要分為3個方向。第1個是開發(fā)其他非甲醇誘導的啟動子。例如3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(PGAP)啟動子可以利用甘油誘導[9]，與鳥苷三磷酸酶分泌相關(guān)聯(lián)的啟動子(PYPT1)[10]，二強丙酮合成酶啟動子(PDHAS)[11]，甲醛脫氫酶啟動子(FLD1)[12]。乙醇誘導的異檸檬酸裂解酶啟動子(PICL1)[13]。轉(zhuǎn)錄延長因子1-α啟動子(PTEF1)[14], 3-磷酸甘油酸激酶啟動子(PPGK1)[15]。但是這些非甲醇誘導啟動子的表達強度都沒有達到AOX1的表達強度，造成外源蛋白表達量不高。第2個是改造AOX啟動子序列，以企得到非甲醇誘導劑誘導AOX1的畢赤酵母工程菌株。研究AOX1啟動子上游序列的調(diào)控原件和調(diào)控蛋白因子是近年來的熱點方向。根據(jù)目前的研究結(jié)果，Vogl等合成了一個畢赤酵母的核心啟動子序列，進而調(diào)控不同的表達強度，也為研究其他非甲醇誘導物提供基礎(chǔ)[17]。HARTNER等通過一系列人工調(diào)整AOX1啟動子序列將報告基因表達量提高60%[18]。WANG通過敲除AOX1啟動子上游的3個轉(zhuǎn)錄抑制因子和1個轉(zhuǎn)錄激活因子得到甘油啟動的AOX1表達元件。這株重組畢赤酵母表達綠色熒光蛋白(GFP)可以到達甲醇誘導AOX1的77%的水平[19]。并且，構(gòu)建了另外一株非甲醇誘導AOX1啟動子可以達到甲醇誘導啟動子的50%的水平[20]。第3個方面是尋找誘導AOX1啟動子的非甲醇誘導劑。例如KUMARI巧妙地利用脂肪酸甲酯誘導畢赤酵母表達脂肪酶，脂肪酶水解脂肪酸甲酯釋放出的甲醇誘導重組畢赤酵母[21]。但是這種方式不能被推廣到表達其他酶的重組畢赤酵母中。TYURIN利用甲酸誘導2株重組畢赤酵母的β-半乳糖苷酶的活性分別達到甲醇誘導水平的35%和95%[22]。本研究以表達木聚糖酶的重組畢赤酵母為試材，確定甲醇誘導的最優(yōu)條件(溫度30℃，pH 5.5，甲醇添加量為1.0 %)和木聚糖酶的最高活力(3 403.8 U/mL)。進而探討了甲酸銨誘導AOX1的強度。圖6結(jié)果表明甲酸銨誘導AOX1的強度較弱。利用甲酸銨和山梨醇聯(lián)合誘導時木聚糖酶的體積產(chǎn)量達到2 032.0 U/mL。甲醇和甲酸銨聯(lián)合誘導時木聚糖酶的體積產(chǎn)量可以達到3 589.2 U/mL。這說明甲酸銨增加了甲醇單獨誘導AOX1的強度。表1分析了不同實驗條件下的單位重組畢赤酵母表達木聚糖酶的結(jié)果。由表1可知甲酸銨誘導下，單位畢赤酵母細胞濃度的木聚糖酶活力為39.9 U/mL OD600，為甲醇誘導時單位畢赤酵母細胞濃度的木聚糖酶活力(97.5 U/mL OD600)的40.9%。添加0.5%山梨醇后，0.5%甲酸銨誘導畢赤酵母的單位細胞濃度的木聚糖酶活力達到150.5 U/mL OD600，比1.0%甲醇和0.08%山梨醇聯(lián)合誘導時單位細胞濃度木聚糖酶活力(113.7 U/mL OD600)提高了32.4%。這說明畢赤酵母單獨代謝甲酸的通量不大，添加山梨醇提供了表達外源蛋白的能源后，提高了外源蛋白的表達。而且甲酸銨和山梨醇更有利于畢赤酵母細胞表達木聚糖酶。不足之處在于甲酸銨和山梨醇誘導時細胞生長較慢，細胞濃度較低，為甲醇和山梨醇聯(lián)合誘導時細胞濃度的58.7%。所以在發(fā)酵罐上利用細胞生長階段和誘導階段分開培養(yǎng)的方式將有利于甲酸銨和山梨醇聯(lián)合誘導優(yōu)勢的體現(xiàn)。

表1　單位重組畢赤酵母細胞表達木聚糖酶的比較Table 1　Specific xylanase activities at different induction conditions

本研究還探討了甲酸銨對甲醇誘導畢赤酵母表達木聚糖酶的影響。甲酸銨和甲醇聯(lián)合誘導畢赤酵母時單位細胞濃度的木聚糖酶活力達到217.5 U/mL OD600。這表明甲醇和甲酸銨聯(lián)合誘導有利于AOX1對外源蛋白的表達，而且表明畢赤酵母還有提高表達木聚糖的空間，為將來研究甲酸銨誘導畢赤酵母的一個內(nèi)容。但是甲酸銨誘導的條件下畢赤酵母的細胞濃度顯著低于甲醇誘導時的生物量。所以，在畢赤酵母高密度發(fā)酵時，甲酸銨和山梨醇聯(lián)合誘導將更有利于畢赤酵母表達外源蛋白。本研究為非甲醇類物質(zhì)誘導畢赤酵母表達外源蛋白提供了基礎(chǔ)。

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