亞麻籽環肽混合物抑制霉菌生長繁殖活性

劉尊, 汪勇, MARTIN J T REANEY, FIORENTY OCTAVIA SUGIWAN,NANDA AYU YULISTYANITA，張寧*

1(廣東高校油脂生物煉制工程技術研究中心，暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州，510632)2(暨南大學 薩斯喀切溫大學 “油料生物煉制與營養”聯合實驗室，廣東 廣州，510632)3(加拿大薩斯喀切溫大學 農業與生物資源學院，加拿大 薩斯卡，S7N5A8)

亞麻又稱胡麻，屬一年生或多年生草本植物，為我國重要油料經濟作物。亞麻籽中含有多種生理活性物質，除了亞麻籽膠和木酚素外，還有一類疏水性環形多肽[1-4]。亞麻籽環肽(flaxseed cyclolinopeptide, FCLPs)主要由異亮氨基酸、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸組成[5]。已從植物、真菌、細菌以及海洋生物中分離得到具有生物活性的環肽[6-8]。相比普通直鏈小分子肽，環肽的環狀結構更具穩定性，高效的抗菌活性以及抗腫瘤、消炎等生理活性[9-12]。亞麻籽環肽A展現了一定的免疫抑制活性[13]，亞麻籽環肽B和環肽E也被報道對細胞分裂素具有抑制作用[14-15]。但亞麻籽環肽對霉菌的抑制作用及機理尚未有報道。

據聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization, FAO)統計，全球約有25%的糧作物受真菌毒素的污染[16-17]。岳淑麗等[18]研究了桉葉精油對酵母菌、細菌和霉菌的抑菌性能，桉葉精油具有良好的抑菌效果，且抑菌性與傘花烯、檸檬烯和桉葉素等抑菌成分有關。HOU等[19]研究了甘氨酸基本多肽在新鮮濕面的應用和抗真菌特性，結果表明隨著甘氨酸基本多肽濃度的提高，對黑曲霉和青霉菌的菌絲生長和孢子萌芽的抑制效果越好。

本文主要通過對宛氏擬青霉和黃曲霉的菌落生長、孢子形成和孢子萌發的抑制作用來評價FCLPs的抗霉菌活性；FCLPs進行經高溫滅菌和未加熱滅菌不同處理，探究環肽的熱穩定性；并初步分析了霉菌培養后，培養基中FCLPs的變化。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1試驗材料

亞麻籽環肽標準品(環肽A、環肽C、環肽E、環肽D)、亞麻籽環肽混合物(純度>60%，其余成分主要為脂肪酸)，Prairie Tide Chemical Inc.；無水乙醇(分析純)，天津市富宇精細化工有限公司；甲醇(色譜純)，MREDA TECHNOLOGY INC.。

1.1.2培養基及試驗菌株

培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA), 廣州環凱微生物科技有限公司。

試驗菌株：宛氏擬青霉(AS 3.776),廣東省微生物菌種保藏中心；黃曲霉(CICC 2476),中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.2　儀器與設備

THZ-98A 型恒溫振蕩箱，上海一恒科技有限公司；HPS-280型生化培養箱，廣州萬寶特種制冷設備有限公司；高溫滅菌鍋，廣州合眾生物科技有限公司；超凈臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；HC-2518高速離心機，科大創新股份有限公司；DZF-6020真空干燥機，上海博迅實業有限公司；LC-20AD 高效液相色譜儀，日本島津公司； Diamonsil C18分析柱(5 μm，150 mm×4.6 mm)，迪馬公司。

1.3　方法

1.3.1亞麻籽環肽混合物溶液制備

稱取亞麻籽環肽混合物粉末溶解于95%的乙醇中，制備得到質量濃度為100 mg/mL的溶液。

1.3.2霉菌孢子懸浮液的配制

將試驗菌株接種于PDA斜面培養基上25 ℃培養7 d。量取10 mL無菌水于試管中，然后用無菌接種環輕輕刮下表面孢子，用無菌水稀釋，充分振蕩搖勻，顯微鏡計數，使菌懸浮液濃度達106CFU/mL。

1.3.3亞麻籽環肽混合物抑制菌落生長活性測定

分別于121 ℃高溫15 min滅菌前、后向PDA平板中添加亞麻籽環肽混合物溶液，使質量濃度梯度為2.4、1.2、0.6、0.3、0.15、0.075 mg/mL。對照組則添加等量等濃度乙醇溶液。用移液槍精確吸取5 μL試驗菌種孢子懸浮液在培養基平板上每120°點種，每組重復3次。待菌液風干后，于25 ℃的恒溫倒置培養， 48 h或72 h十字交叉法測量菌落直徑，取平均值，計算抑制菌落生長活性：

(1)

式中：I為抑制菌落生長活性；d1為對照組菌落直徑；d2為亞麻籽環肽組菌落直徑。

1.3.4亞麻籽環肽混合物抑制霉菌孢子形成測定

取1.3.3 培養了72 h后的菌落平板，加入10 mL無菌水，用涂布棒將平板上孢子輕刮下來制成孢子懸浮液，孢子懸浮液經過梯度稀釋，采用傾注法平板計數，按公式(2)計算孢子形成抑制率，用EXCEL統計軟件求出亞麻籽環肽混合物對孢子形成的IC50值。

(2)

式中：I′為孢子形成抑制率；C1為對照組孢子數；C2為亞麻籽環肽組孢子數。

1.3.5亞麻籽環肽混合物抑制霉菌孢子萌芽率

取50 mL的三角瓶加入20 mL的察氏液體培養基，加入適量的亞麻籽環肽混合物溶液配制最終質量濃度為0.6 mg/mL。隨后移取適量孢子懸浮液至察氏液體培養基中，置于30 ℃下振蕩恒溫培養48 h。取1滴培養液于載玻片上后在高倍鏡下觀察孢子發芽情況，取平均值。乙醇作為對照。按公式(3)計算亞麻籽環肽混合物對孢子萌發的抑制率。

(3)

1.3.6霉菌PDA中環肽的提取

從抑菌試驗PDA平板培養物中提取亞麻籽環肽，對比亞麻籽環肽在培養霉菌前后的變化。培養霉菌的PDA平板取0.3 g培養基，轉移至2 mL離心管，加入1.4 mL 100%無水乙醇溶液振蕩破碎獲均勻懸浮液。懸浮液以4 000 r/min，離心10 min，取上清液在真空干燥箱中放置6 h除去乙醇。干燥后樣品溶于1 mL色譜純甲醇，0.45 μL過濾膜過濾后作為高效液相色譜分析樣品待用。

1.3.7高效液相色譜分析亞麻籽環肽組分

使用 Diamonsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)； 流動相A為乙腈，流動相B為蒸餾水，柱溫為35 ℃，紫外檢測波長為214 nm，進樣體積為10 μL，采用梯度洗脫，外標法定量。HPLC梯度洗脫程序如下[20]： 0 min，50%A-50%B；0～6 min，50%A-50%B；6～7 min，65%A+35%B；7～19 min，65%A+35%B；19～22 min，66%A+34%B；22～23 min，70%A+30%B；23～24 min，100%A； 24～31 min，50%A-50%B；31～41 min，50%A+50%B。0～23min內，流速均為0.5 mL/min，24～41 min內的流速均為1 mL/min。

2　結果與分析

2.1　亞麻籽環肽混合物對宛氏擬青霉的抑制作用

表1和表2分別為不同質量濃度的FCLPs對宛氏擬青霉的菌落生長和孢子形成的抑制結果。

由表1可知，隨著FCLPs的增加，宛氏擬青霉菌落生長和孢子的抑制效果增強，未高溫滅菌的FCLPs在質量濃度為1.2 mg/mL時，對菌落生長抑制率I(48.5%)和孢子形成抑制率I′(77.3%)均達最大抑制活性。72 h的抑制率I( 36.0%)相比48 h (48.5%)略有下降，表明培養時間的延長會減弱抑菌效果。FCLPs對宛氏擬青霉孢子形成的抑制率高于對菌落生長的抑制率，推測FCLPs可能抑制了菌絲的分化。經高溫滅菌和未高溫滅菌的FCLPs對宛氏擬青霉孢子形成的半數抑制濃度IC50值分別為0.53 mg/mL和0.34 mg/mL。相同質量濃度下，高溫滅菌后FCLPs對宛氏擬青霉的抑制率I和I′的抑制活性最多分別降低23.2%(0.15 mg/mL)和23.3%(0.6 mg/mL)，說明高溫處理(121 ℃, 15 min)后的FCLPs仍可保持76.5%左右的抑菌活性。

表1　不同質量濃度的亞麻籽環肽混合物對宛氏擬青霉菌落生長的抑制效果Table 1　Inhibition of FCLPs on the radial growth ofPaecilomyces varioti Bainier

表2　不同質量濃度的亞麻籽環肽混合物對宛氏擬青霉孢子形成的抑制效果Table 2　Inhibition of FCLPs on spores formation ofPaecilomyces varioti Bainier

2.2　亞麻籽環肽混合物對黃曲霉的抑制作用

亞麻籽環肽混合物對黃曲霉菌落生長和孢子形成的抑制作用見表3和4。未高溫滅菌的FCLPs對黃曲霉的抑制率I和I′都在2.4 mg/mL時最高，分別為32.9%和86.8%。48 h時抑制活性I(32.9%)高于72h (26.9%)，同宛氏擬青霉實驗結果一致。經高溫滅菌和未高溫滅菌的FCLPs對黃曲霉孢子形成的IC50值分別為0.31和0.24 mg/mL。與宛氏擬青霉的抑菌效果相比，FCLPs對黃曲霉的抑制率I遠低于宛氏擬青霉，但是抑制率I′略高于宛氏擬青霉。可以推測，FCLPs對宛氏擬青霉和黃曲霉的抑制機理，可能不是抑制營養菌絲體的生長，而是通過抑制氣生菌絲體的孢子分化，從而可以解釋FCLPs對2株霉菌的孢子生長抑制率要高于對菌落生長的抑制率。高溫滅菌處理使FCLPs的抑制活性部分喪失，最低可保持 41.7%(抑制孢子形成)的活性。

表3　不同質量濃度的亞麻籽環肽混合物對黃曲霉菌落生長的抑制效果Table 3　Inhibition of FCLPs on the radial growth ofAspergillus flavus

表4　不同質量濃度的亞麻籽環肽混合物對黃曲霉孢子形成的抑制效果Table 4　Inhibition of FCLPs mixtures on spores formationof Aspergillus flavus

2.3　亞麻籽環肽混合物對霉菌孢子萌芽的抑制作用

未高溫滅菌的FCLPs(0.6 mg/mL)，對宛氏擬青霉和黃曲霉的孢子萌芽的抑制作用結果見表5。相比對照組，FCLPs對宛氏擬青霉和黃曲霉都表現了對霉菌孢子萌芽的抑制效果，平均抑制率分別為8.22%和18.5%，黃曲霉組的孢子萌芽率要明顯高于宛氏擬青霉，說明FCLPs對宛氏擬青霉孢子發芽的抑制作用要強于對黃曲霉孢子。

2.4　霉菌培養基中殘留環肽的分析

圖1為從培養宛氏擬青霉的PDA培養基中提取的FCLPs，圖2是從黃曲霉的PDA培養基中提取的FCLPs。參照左洋等[21-22]所做的標準品的HPLC結果，環肽C信號峰的保留時間為15 min左右，隨后出峰的是環肽E(19 min左右)、環肽D(20 min左右)、環肽A(27 min左右)，其保留時間及出峰順序與標準樣品是基本一致的，結果表明經過霉菌培養后，FCLPs的已知的4種環肽的比例沒有發現明顯的變化，也沒有發現培養基中環肽霉菌代謝物的產生。但是對比高溫滅菌和未經高溫滅菌的FCLPs，可以看到熱處理過后的FCLPs中的4種環肽的峰面積較未經熱處理的有所降低，這表明高溫熱處理降低了環肽C、E、D和A的含量，這可能影響了FCLPs的抑菌活性，這與前面發現的高溫處理導致FCLPs的抑菌活性下降的結果是一致。

表5　亞麻籽環肽混合物對霉菌孢子萌芽的抑制作用Table 5　Inhibition of FCLPs against fungal spore germination

圖1　1.2 mg/mL宛氏擬青霉PDA提取亞麻籽環肽(未高溫滅菌和高溫滅菌)的HPLC譜圖Fig.1　HPLC of 1.2 mg/mL FCLPs (not autoclaved andautoclaved) extracted from Paecilomyces variotibainier PDA

圖2　2.4 mg/mL黃曲霉PDA提取亞麻籽環肽(未高溫滅菌和高溫滅菌)HPLC譜圖Fig.2　HPLC of 2.4 mg/mL FCLPs (not autoclaved andautoclaved) extracted from Aspergillus flavus PDA

3　結論

本文選取宛氏擬青霉和黃曲霉2株霉菌作為試驗菌株，通過菌落生長直徑、孢子計數和孢子萌芽率評價121 ℃高溫滅菌前后不同濃度的FCLPs對霉菌的抑制活性。結果表明，FCLPs的抑菌活性隨濃度升高而增強，對宛氏擬青霉的抑制活性最高達48.5% (菌落生長)和77.3% (孢子形成)；對于黃曲霉，抑制活性最高分別為32.9% (菌落生長)和86.8% (孢子形成)。FCLPs對宛氏擬青霉孢子的IC50值分別為0.53 mg/mL(經高溫滅菌)和0.34 mg/mL(未高溫滅菌)；對黃曲霉孢子的IC50值則分別為0.31 mg/mL(經高溫滅菌)和0.24 mg/mL(未高溫滅菌)。高溫滅菌后FCLPs保持了部分抑菌活性。通過孢子萌芽試驗發現，FCLPs對2株霉菌的孢子萌芽都有明顯的抑制效果，且對宛氏擬青霉孢子萌芽的抑制率高于對黃曲霉孢子的抑制率。通過高效液相色譜對霉菌PDA培養基中提取的FCLPs的分析，發現對比已知的亞麻籽環肽標準樣品圖譜，環肽A、C、D和E在霉菌培養前后沒有產生新的環肽代謝物，但是高溫熱處理會降低環肽的含量，從而導致抑菌活性有所減弱。綜上所述，FCLPs具有抑制宛氏擬青霉和黃曲霉孢子形成、萌發和菌絲生長活性，高溫滅菌后還能保持部分活性，表明其具有良好的熱加工適應性，有潛力成為新型天然防腐劑。

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