鳀魚蒸煮液的殼聚糖絮凝潔凈化及機理分析

林龍，戚雅楠，丁玉庭，張建友

(浙江工業大學海洋學院，浙江 杭州，310014)

鳀魚是鳀屬(Engraulis)魚類的統稱，分布于南北半球的溫帶沿海水域，是一種中上層集群性魚類，亦是世界海洋捕撈量最大的魚種，年產量大約有900萬t[1]，中國近海鯷魚資源主要以日本鯷魚為主[2]。鳀魚捕獲后一般加工成干制品，加工過程產生大量的蒸煮液，每加工1t鳀魚，就會產生1.5t左右蒸煮液。蒸煮液中含有豐富的蛋白質、氨基酸、核苷酸及一些鈣、鉀、磷、鐵等礦物質。對于蒸煮液的深加工，用于生產調味品、蛋白營養強化劑等食品具有較好的市場前景。膜濃縮是蒸煮液回收利用的重要加工途徑，但蒸煮液中含有大量的懸浮物，有機質含量高，在膜濃縮過程中，容易形成膜污染，使通量快速衰減[3]。因此，對蒸煮液進行潔凈化處理顯得十分必要，不但可以回收蒸煮液中的蛋白質，而且可降低蒸煮液的有機質含量，減緩膜污染，延長膜組件運行周期。食品加工中，常見的潔凈化處理方式有過濾、離心和絮凝[4-7]等方法。其中，由于過濾的時間較長，離心又不能除去水溶性物質，應用的局限性較大。

絮凝不僅具有分離懸浮物等雜質的作用，而且具有去除部分水溶性物質的功能，因此更具有凈水除雜的效用。絮凝過程中，膠體脫穩形成分散的絮狀膠體與絮凝劑發生電中和、吸附架橋等作用聚集成大顆粒物質[8]。在眾多天然高分子絮凝劑中，殼聚糖是從自然界廣泛存在的幾丁質(chitin)經過脫乙酰作用得到的一種陽離子型絮凝劑，具有無毒、易生物降解和較強的螯合、絡合能力等優點，廣泛應用于凈化飲用水、食品與發酵工業廢水的絮凝工藝中。GUERRERO等[7]和WIBOWO等[9]使用殼聚糖絮凝回收魚糜加工廢水中的蛋白質，其中殼聚糖/藻朊酸鹽復合絮凝劑對蛋白質的回收率達到80%以上。另外，殼聚糖也具有去除金屬離子的能力，GAMAGE等[10]的研究表明，殼聚糖填充柱對工業廢水中Hg、Pb、Cd等重金屬元素的去除率高達95%以上。同時，CHENG等[11]在絮凝凈化飲用水研究發現，添加0.2 mg/L的殼聚糖具有高效的除菌抑菌效果，而且LERTSUTTHIWONG[12]在凈化養殖蝦池水體時也使用殼聚糖絮凝去除浮游生物。

因此，為了凈化鳀魚蒸煮液，在不同pH條件下殼聚糖與蒸煮液中溶性蛋白的絮凝過程中，通過對溶解曲線、紅外光譜、分子質量分布、重金屬及氨基酸含量的變化進行分析，探究適宜的絮凝pH值和絮凝機理。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

鳀魚蒸煮液(鹽含量為2.51%，pH=5.9～6.0)的蒸煮時間一般控制在4～5 h，由浙江瑞安市華盛水產有限公司提供，-18℃冷凍保藏，試驗前流水解凍待用。

1.2　儀器設備

HPLC高效液相(2695)，美國Waters公司；ICP-AES分析儀(IRIS Intrepid)，美國熱電TJA公司；FT-IR紅外光譜分析儀(Nicolet 6700)，美國Thermo公司；氨基酸分析儀(SYKAM433D)，德國Cham公司。

1.3　實驗方法

1.3.1流程

研究蒸煮液pH對水溶性蛋白絮凝效果的影響。試驗流程如圖1所示，蒸煮液中加入殼聚糖絮凝劑，添加量為1 g/L，pH值降至5.5后，調節pH使其在1～12范圍內，在室溫條件下，低速攪拌30 min后，離心過濾，上清液進行水溶性蛋白含量和分子質量分布測定，沉淀物進行紅外分析。然后，在不添加絮凝劑的條件下，直接調節蒸煮液的pH使其在1～12范圍內，在室溫條件下，低速攪拌30 min后，離心過濾，上清液進行水溶性蛋白含量和分子質量分布測定。

圖1　pH值對殼聚糖絮凝水溶性蛋白影響的試驗流程圖Fig.1　The experimental flow chart of the influence of pHon flocculation of water soluble proteins by Chitosan

1.3.2蛋白質含量測定[13]

采用雙縮脲比色法測定。蒸煮液8 000 g離心后，1 mL上清液與4 mL雙縮脲試劑混合，顯色30 min后540 nm測定。

1.3.3蛋白質分子質量及分布測定[14-16]

采用HPLC(高效液相色譜)方法測定蒸煮液中蛋白質分子質量及分布。色譜柱為TSK-GEL G3000-PWXL(7.8 mm×300 mm，孔徑7 μm)，柱溫25℃，流動相為0.05 mol/L Na3PO4緩沖液(pH=7.2)，流速0.5 mL/min，檢測波長為280 nm。鐵蛋白(450 kDa，Sigma)、牛血清蛋白(66.43 kDa，Aladdin)、核糖核酸酶(13.7 kDa，Sigma)、胰島素(5.73 kDa，Sigma)和B12(1 355 Da，Aladdin)標準品在相同色譜條件測定出峰時間。分子質量的對數(lgMw)與出峰時間(T)呈良好的線性關系，回歸方程：lgMw=-0.180 0T+7.419 1，R2=0.988 5。

1.3.4紅外光譜分析[17]

蒸煮液8 000 g(4℃)離心10 min，沉淀物質經冷凍干燥后研磨成粉末狀，加入KBr混合研磨，壓片后放入紅外光譜儀中掃描，波數范圍4 000～400 cm-1。

1.3.5水溶性固形物含量

參考GB/T 10786—2006。

1.3.6氨基酸組成及含量分析[18]

蒸煮液用5-磺基水楊酸(質量分數2%)沉淀蛋白后，8 000 g(4℃)離心10 min，上清液過0.45 μm水系膜后經氨基酸自動分析儀測定。

1.3.7重金屬離子測定[10, 19]

采用ICP-AES(電感耦合等離子發射光譜儀)方法測定蒸煮液中砷(As)、鎘(Cd)、鉻(Cr)、汞(Hg)、鉛(Pb)和硒(Se)元素的含量。取15 mL樣品于聚四氟乙烯消解罐中，消解罐中加入10 mL HNO3，在電子加熱板中90℃消解4 h，消解后溶液呈透明略帶黃色。用超純水定容于50 mL容量瓶中，每個樣品做3個平行，同時做空白試驗。ICP-AES射頻功率1 050 kW，霧化壓力4.25 MPa,，輔助氣流速1.0 L/min，樣品提升量1.70 mL/min，樣品沖洗時間1 min，高波掃描5 s，低波掃描30 s。

1.4　數據分析

圖表數據采用Origin8.0和Excel 2013軟件進行統計、分析以及繪圖，顯著性分析p>0.05為不顯著。

2　結果與分析

2.1　溶液pH對水溶性蛋白溶解性的影響

圖2中水溶性蛋白的溶解曲線表明，蒸煮液pH=3時水溶性蛋白的殘留率最低，溶解度最小，即蒸煮液水溶性蛋白的等電點pI=3左右。當蒸煮液pH逐漸增大時，水溶性蛋白表面攜帶的負電荷增加，溶解度增加。但是當蒸煮液呈堿性后，部分水溶性蛋白逐漸形成沉淀，可能是由于蒸煮液中由鯷魚引入了堿不溶性金屬離子Ca和Mg，形成Ca(OH)2和Mg(OH)2絮凝核心引起蛋白質沉淀。王路[20]檢測了阿拉斯加狹鱈魚糜的漂洗廢水中金屬離子組成，也發現了Ca和Mg離子是堿不溶金屬離子中含量最高的元素。

圖2　蒸煮液pH值對水溶性蛋白溶解和絮凝的影響Fig.2　Effect of pH on the solubility and flocculation ofwater soluble protein

不同pH條件下蒸煮液中水溶性蛋白溶解性的差異通過蛋白分子質量分布的GPC圖譜(圖3)可知，在溶液pH=3、4、5.5和10 條件下水溶性蛋白的分子質量分布差異主要集中在出峰時間10～16 min，pH=5.5的起始出峰時間在10.41 min(331 kDa)，pH=10的起始出峰時間在11.31 min(241 kDa)，pH=4的起始出峰時間在11.96 min(181 kDa)，pH=3的起始出峰時間在13.35 min(103 kDa)，即溶液pH值的改變，主要影響大分子水溶性蛋白的溶解性，對分子質量小于19 kDa的蛋白質溶解性幾乎沒有影響。同時pH=5.5、10、4和3的峰面積依次減少，與圖2中水溶性蛋白溶解曲線的變化趨勢一致。

2.2　絮凝pH對殼聚糖絮凝水溶性蛋白的影響

圖3　不同pH值條件下蒸煮液水溶性蛋白分子質量分布圖(GPC)Fig.3　The molecular weight distribution of water solubleprotein in cooking liquor under different pH conditions (GPC)

圖4　pH值對殼聚糖溶解性能的影響Fig.4　Effect of pH on the solubility of Chitosan

圖5　不同pH絮凝后水溶性蛋白分子質量分布圖(GPC)Fig.5　The molecular weight distribution of water solubleprotein in cooking liquor after different pH flocculation (GPC)

2.3　殼聚糖絮凝蛋白沉淀物的紅外分析

通過對不同pH條件下殼聚糖絮凝水溶性蛋白產生的沉淀物進行紅外掃描分析，如圖6所示。

圖6　不同pH絮凝沉淀物的紅外光譜分析Fig.6　FTIR spectra of different pH flocculation precipitates

2.4　pH=3與pH=5.5殼聚糖絮凝的GPC比較

溶液pH=5.5和蒸煮原液(pH=6)中水溶性蛋白的溶解度相同，蛋白質分子質量分布的GPC圖也相同。

圖7　pH=3和pH=5.5條件下水溶性蛋白溶解性能和絮凝性能比較(GPC圖)Fig.7　Comparison of solubility and flocculation properties ofwater soluble protein at pH=3 and pH=5.5 (GPC)

由圖7表明，殼聚糖絮凝pH=5.5時，蒸煮液中分子質量大于53 kDa的蛋白質完全被去除，分子量在53～19 kDa的蛋白質峰面積明顯下降。溶液pH=3時，蒸煮液中分子質量大于103 kDa的蛋白質已完全不溶于水；殼聚糖絮凝pH=3時，能除盡分子質量大于43 kDa的蛋白質，后者蒸煮液水溶性蛋白的殘留量比前者減少了9.30%，說明pH=3時殼聚糖絮凝效果最好的原因不僅是由于殼聚糖-NH2的質子化作用達到最大[26]，而且蒸煮液中水溶性蛋白的溶解度也達到最低。pH=3時殼聚糖的絮凝效果比絮凝pH=5.5提高23.12%；但是殼聚糖絮凝pH=5.5時可以簡化絮凝操作。蒸煮液中添加殼聚糖絮凝劑后，pH值從5.9～6.0降至5.5左右，不必再調節pH值，減少引入酸堿物質，盡量保持原有的風味。因此，選擇殼聚糖的絮凝pH值為5.5。

2.5　殼聚糖對蛋白絮凝能力的分析

殼聚糖對水溶性蛋白的去除率最大為36.23%(圖2)，與WIBOWO和GAMAGE等[9-10]的研究結果相差較大。這可能存在的原因有：第一，蒸煮液的鹽含量(2.51%)較高，離子強度大，影響殼聚糖和蛋白質的靜電結合，使殼聚糖的絮凝能力降低[24, 27-29]；第二，殼聚糖對大分子蛋白質具有較好的絮凝能力，但對小分子蛋白質無絮凝作用。因為如圖8所示蒸煮原液主要是以小分子蛋白為主，分子質量小于19 kDa的蛋白質占58%左右。蛋白沉淀劑TCA(三氯乙酸)與殼聚糖絮凝劑相比，TCA對蛋白質具有較好的沉淀作用[30]，添加量為5 g/100mL時蒸煮原液水溶性蛋白的去除率達到55.71%，分子質量小于19 kDa的蛋白峰面積明顯小于蒸煮原液和絮凝pH=3的GPC圖，表明TCA不僅對大分子蛋白質有較好的沉淀作用，而且對小分子蛋白質同樣具有一定的沉淀作用。殼聚糖絮凝pH=3的GPC圖表明殼聚糖對蒸煮液中分子質量大于19 kDa的水溶性蛋白具有較好的絮凝作用，絮凝去除效率是TCA的65%。

圖8　殼聚糖絮凝和TCA沉淀水溶性蛋白性能比較(GPC圖)Fig.8　Comparison of the properties of water soluble proteinby chitosan flocculation and TCA precipitation (GPC)

2.6　絮凝后水溶性固形物和重金屬含量的變化

在pH=5.5條件下，殼聚糖絮凝前后鳀魚蒸煮液中水溶性固形物、水溶性蛋白、游離氨基酸和重金屬含量分別見表1和表2。殼聚糖絮凝后水溶性固形物含量降低6.72%，主要是由于水溶性蛋白含量降低引起；而各種游離氨基酸的含量變化不顯著，表明殼聚糖絮凝不影響氨基酸含量的變化。同時，由于顆粒狀殼聚糖對重金屬離子有較強螯合、絡合作用，溶解狀態的殼聚糖同樣具有一定去除重金屬元素的作用。實驗結果表明，絮凝前后鉻、硒、砷和汞元素的含量有顯著性差異，分別降低52.82%、40.95%、21.92%和13.63%。

表1　絮凝前后可溶性固形物、水溶性蛋白和游離氨基酸含量的變化(p>0.05不顯著)Table 1　Changes of soluble solids, water soluble proteinand free amino acid content after flocculation (p>0.05)

注：數字上標小寫字母相同表示差異不顯著，字母不相同表示差異顯著，表2同。

表2　絮凝前后重金屬含量的變化(p>0.05不顯著)Table 2　The change of heavy metal content afterflocculation (p>0.05)

3　結論

(1)在不同pH條件下殼聚糖與鯷魚蒸煮液水溶性蛋白的絮凝機理的試驗中發現，堿性環境中，殼聚糖主要通過吸附作用形成沉淀物；而酸性環境中，殼聚糖絮凝主要通過電中和作用和吸附架橋作用，形成類似蛋白-殼聚糖-蛋白的結構。不同的酸堿環境表現出不同的絮凝能力，酸性環境則更有利于殼聚糖與蛋白的絮凝作用。絮凝pH=3時的絮凝效果最好，但是水溶性蛋白絮凝去除率只達到36.23%，說明殼聚糖對蒸煮液水溶性蛋白絮凝潔凈化能力不足，這可能是因為殼聚糖對大分子水溶性蛋白具有較好的絮凝能力，而蒸煮液分子量小于19 kDa的蛋白質基本不參與絮凝作用引起的。

(2)在絮凝pH=3和pH=5.5的比較中，選擇殼聚糖絮凝pH=5.5更符合蒸煮液潔凈化的理念，加入更少的酸堿物質，絮凝過程變得更加簡單經濟，便于工業化應用。絮凝pH=5.5時絮凝后蒸煮液蛋白質和鉻、硒、砷和汞元素含量顯著降低，但氨基酸含量無顯著變化，保持了氨基酸對鯷魚蒸煮液風味的貢獻。

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