柴達敏鹽湖產胞外蛋白酶嗜鹽古菌的篩選及其酶學性質

侯靖，許文梅，崔恒林

(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇　鎮江，212013)

蛋白酶能催化蛋白質肽鍵的水解，是用途最廣泛的酶制劑之一，廣泛應用于食品、洗滌、皮革等領域，在全球的銷售額占酶制劑總份額的46%左右[1]。目前對蛋白酶的研究主要集中在尋求具有特殊性質的微生物酶來解決工業應用中酶蛋白有限穩定性的問題以及擴大其應用領域，這些特殊的性質包括耐熱性、耐鹽性、穩定性強等[2]。極端微生物是最適生活在極端環境中的微生物的總稱，包括嗜熱、嗜冷、嗜鹽、嗜酸、嗜堿、嗜壓等多種類型。極端微生物通常具有獨特的生理機制及代謝產物，能夠提供豐富的極端酶資源。

嗜鹽古菌是一類通常生活在鹽湖、曬鹽場、腌制食品等高鹽環境中的極端微生物，與大部分極端微生物相比，具有易培養、生長快等特點，在生物技術方面具有廣泛的應用前景[3]。從自然環境中篩選具有優良酶學性質的嗜鹽古菌胞外蛋白酶成為近年來國內外學者的研究熱點。DAMMAK等人從突尼斯的斯法克斯曬鹽場分離得到1株高產胞外蛋白酶的嗜鹽古菌HalorubrumezzemoulenseETR14，并報道了其蛋白酶耐鹽堿、熱穩定的特征[4]。ELBANNA等人從位于埃及法尤姆美利斯湖的Emisal鹽業公司的粗制鹽中分離獲得一株產蛋白酶菌株Halobacteriumsp. HP25，并發現其蛋白酶耐鹽堿、耐熱，并且能夠耐受一定的有機溶劑和表面活性劑[5]。AKOLKAR等人從印度坎德拉鹽田的鹵水樣品中分離獲得Halobacteriumsp. SP1(1)菌株，研究了其胞外蛋白酶酶學性質[6]，并將其用于改良傳統魚露發酵工藝，縮短魚露發酵時間[7]。我國學者石萬良等人對分離自湖北應城鹽礦的Natrinemasp. R6-5菌株所產胞外蛋白酶進行了純化以及酶學性質表征[8]，高瑞昌等人研究了分離自江蘇如東鹽田的HalogranumrubrumRO2-11菌株的胞外蛋白酶性質[9]。然而，相對于豐富的高鹽環境和嗜鹽古菌資源，對其胞外蛋白酶的研究尚處于起步階段，尤其是對反應條件要求不嚴格的蛋白酶資源仍有很大挖掘空間[5]。

本研究從分離自我國內蒙古柴達敏鹽湖的嗜鹽古菌中篩選高產胞外蛋白酶菌株，并對所產蛋白酶的酶學性質進行初步研究，為進一步分離純化及工業應用提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

39株嗜鹽古菌分離自內蒙古柴達敏鹽湖。

酵母提取物、魚蛋白胨：OXOID試劑公司；脫脂奶粉、酪蛋白、PCR擴增試劑盒：上海生工生物技術服務有限公司；其他試劑：國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

NHM培養基成分(g/L)：酵母提取物0.05，魚蛋白胨0.25，丙酮酸鈉1.0，KCl 5.4，CaCl20.29，NH4Cl 0.27，MgSO4·7H2O 26.8，MgCl2·6H2O 23.0，NaCl 184.0，K2HPO40.3，pH 7.0。AHM培養基成分(g/L)：酵母提取物0.05，魚蛋白胨0.25，丙酮酸鈉1.0，KCl 5.4，NaNO30.5，CaCl20.1，MgSO4·7H2O 0.1，NaCl 184.0，pH 9.0。固體培養基添加20 g/L瓊脂。

本研究使用的緩沖液包括50 mmol/L磷酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 6.0)，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0、8.0、9.0)，50 mmol/L硼砂-氫氧化鈉緩沖液(pH 10.0、11.0)，以及含有不同濃度NaCl的相應pH的緩沖液。

1.2　儀器與設備

電子天平：上海精科天平儀器廠；pHS-3TC型酸度計：上海天達儀器有限公司；全自動滅菌鍋：上海三申醫療器械有限公司；超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；LRH-250生化培養箱：上海一恒科技有限公司；HBA-1151PCR儀：MJ Research公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；HYG-C型多功能搖床：太倉實驗設備廠；Avanti J-14離心機：Beckman公司；HH-S2數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫療儀器廠；DU800TM核酸蛋白分析儀：Beckman-Coulter公司。

1.3　方法

1.3.1產胞外蛋白酶菌株篩選

CDM1～CDM12這12株嗜鹽古菌經NHM培養基活化，CDA1～CDA27這27株嗜鹽古菌經AHM培養基活化。配制含5 g/L脫脂奶粉的NHM或AHM平板，取5 μL活化后的菌液接種到脫脂奶粉平板，于37 ℃培養4 d形成明顯的菌苔。產胞外蛋白酶菌株的菌苔周圍有透明圈，否則，沒有透明圈。根據透明圈直徑與菌苔直徑之比初步評價產蛋白酶能力。

1.3.216S rRNA基因序列分析

取少量菌體加入30～50 μL無菌水，沸水浴10 min裂解細胞，作為PCR模板。引物0018F和1518R用于擴增16S rRNA基因[10]。PCR產物測序由北京諾賽基因組研究中心完成。NCBI BLAST用于基因序列分析。

1.3.3粗酶液的制備

CDM1～CDM12這12株嗜鹽古菌經NHM培養基活化，CDA1～CDA27這27株嗜鹽古菌經AHM培養基活化，以2%的比例接種于200 mL NHM或AHM培養基中，37 ℃，160 r/min培養至穩定期。于4 ℃，9 000×g離心15 min，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾，再采用截留分子量為10 kDa的超濾離心管(Millipore)濃縮10倍，即得粗酶液。

1.3.4蛋白酶活力的測定

參照福林酚法測定蛋白酶活力[11]。稱取2.00 g酪蛋白，加入70 mL緩沖液和100 μL 10 mol/L NaOH溶液，沸水浴加熱至酪蛋白完全溶解，定容至100 mL，調節pH值至緩沖液相應的值，即得酪蛋白溶液。

將25 μL酶液用緩沖液稀釋10倍至250 μL后，加入250 μL相應緩沖液配制的酪蛋白溶液，一定溫度下反應30 min，加入500 μL 100 g/L三氯乙酸溶液終止反應。37 ℃放置30 min后，于4 ℃，9 000×g離心10 min，向500 μL上清液中加入2.5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液和0.5 mL 33%福林酚試劑，40 ℃顯色20 min，于4 ℃，9 000×g離心10 min，于680 nm測定上清液的吸光度。空白對照反應體系即在酶液中先加入三氯乙酸溶液，后加入酪蛋白溶液。蛋白酶將酪蛋白水解成酪氨酸等物質，利用酪氨酸標準曲線，得到酪氨酸的量計算蛋白酶活力。1個酶活力單位(U)定義為特定反應條件下，每分鐘產生1 μg酪氨酸的酶量。

1.3.5酶學性質的研究

1.3.5.1最適反應溫度

將25 μL酶液用2 mol/L NaCl，pH 7.0緩沖液稀釋10倍至250 μL后，分別在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃下反應，測定酶活力。

1.3.5.2熱穩定性

將25 μL酶液用2 mol/L NaCl，pH 7.0緩沖液稀釋10倍至250 μL后，在30、50、70、90 ℃下分別放置0、20、40、60 min，在最適溫度下測定酶活力。

1.3.5.3最適反應pH

分別用含2 mol/L NaCl的pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0緩沖液將25 μL酶液稀釋10倍至250 μL后，在最適溫度下測定酶活力。

1.3.5.4最適反應NaCl濃度

分別用含有0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mol/L NaCl的緩沖液將25 μL酶液稀釋10倍至250 μL后，在最適溫度、最適pH下測定酶活力。

1.3.5.5NaCl濃度穩定性

分別用含有0、1.0、2.0、3.0 mol/L NaCl的緩沖液將25 μL酶液稀釋10倍至250 μL后，在30 ℃放置0、20、40、60 min，隨后分別與250 μL含3.0、2.0、1.0、0 mol/L NaCl的酪蛋白溶液在最適溫度、最適pH下測定酶活力。

1.3.5.6抑制劑對蛋白酶活力的影響

用最適緩沖液將25 μL酶液稀釋10倍至250 μL后，分別加入1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、1 mmol/L對氯汞苯甲酸(p-chloromercuribenzoic acid，PCMB)、5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、0.1 mmol/L胃蛋白酶抑制劑(pepstatin A)，30 ℃放置20 min，在最適條件下測定酶活力。對照反應體系不加抑制劑。

1.4　數據分析

酶學性質研究所有試驗均測定3次，以“平均值±標準差”表示。采用SPSS 18.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和事后檢驗(Turkey法)，p<0.05為差異有統計學意義。

2　結果與分析

2.1　產胞外蛋白酶菌株的篩選

從表1可以看出，分離自內蒙古柴達敏鹽湖的39株嗜鹽古菌中，8株能夠在NHM或AHM-脫脂奶粉平板上產生水解圈。16S rRNA基因序列分析表明CDA5、CDA6、CDA14、CDA16和CDA17與HalovivaxcerinusIC35菌株的16S rRNA基因序列的相似性為95%～96%。CDM10與NatribaculumlongumTRM20345 的16S rRNA基因序列的相似性為93%。CDM12與HalovariusluteusDA50的16S rRNA基因序列的相似性為95%。CDA27與NatronorubrumtexcoconenseJCM 17497的16S rRNA基因序列的相似性為99%。通常16S rRNA基因序列相似性小于98.65%認為屬于不同的種[12]，相似性小于95%認為屬于不同的屬[13]。因此，除了CDA27外，其他7株菌可能為新的分類單元。

8株菌水解圈直徑與菌苔直徑的比值范圍為2.29～4.72，其中CDM10和CDM12比值在4.0以上。將這8株菌進行搖瓶發酵，在2 mol/L NaCl、35 ℃、pH 7.0的條件下測定酶活，CDM10和CDM12的蛋白酶活力分別為11.1和14.3 U/mL，其他菌株的酶活力均低于10 U/mL。因此，CDM10和CDM12用作進一步研究對象。總的來說，水解圈直徑與菌苔直徑的比值和液體發酵蛋白酶活的高低大致呈正相關。

表1　產胞外蛋白酶菌株Table 1　Extracellular protease-producing haloarchaeal strains

2.2　CDM10和CDM12胞外蛋白酶酶學性質研究

2.2.1最適反應溫度與熱穩定性

從圖1可以看出，CDM10和CDM12的蛋白酶在35～80 ℃內均有酶活，隨著溫度升高，酶活先增加后降低。CDM10的蛋白酶最適反應溫度為70～75 ℃(p>0.05)，在65～80 ℃內具有較高酶活(最高酶活的80%以上)。CDM12的蛋白酶最適反應溫度為60～75 ℃(p>0.05)，在55～75 ℃內具有較高酶活(最高酶活的80%以上)。因此，CDM10和CDM12的胞外蛋白酶均具有良好的耐熱性，其中CDM10的蛋白酶在55～70 ℃內酶活仍然隨著溫度升高迅速增加，而CDM12的蛋白酶在此溫度范圍內酶活緩慢增加。

圖1　CDM10和CDM12蛋白酶的最適反應溫度Fig.1　The optimum temperature for protease activitiesof CDM10 and CDM12

從圖2可以看出，CDM10的蛋白酶在30、50 ℃具有良好的穩定性(p>0.05)，在70、90 ℃隨著處理時間增加酶活略有降低(p<0.05)。70 ℃處理60 min后酶活降低13.2%，90 ℃處理60 min后酶活降低17.6%。CDM12的蛋白酶在30、50℃具有良好的穩定性(p>0.05)，在70、90 ℃隨著處理時間延長酶活略有降低(p<0.05)。70 ℃放置60 min后酶活降低19.0%，90 ℃放置60 min后酶活降低30.1%。因此，CDM10和CDM12的胞外蛋白酶具有較好的熱穩定性，CDM10胞外蛋白酶的熱穩定性優于CDM12。蛋白酶良好的熱穩定性對于工業應用非常重要，因為很多工業過程均需在一定的溫度維持較長時間。

圖2　不同溫度處理對CDM10(a)和CDM12(b)蛋白酶活力的影響Fig.2　Effect of pre-incubation at different temperatureson protease activities of CDM10 (a) and CDM12 (b)

2.2.2最適反應pH

從圖3可以看出，CDM10和CDM12的蛋白酶在pH 6.0～11.0范圍內均具有催化活性，隨著pH升高，酶活先升高后降低。CDM10蛋白酶的最適反應pH為8.0～9.0(p>0.05)。pH 6.0時的酶活為最高酶活的43.5%；pH 11.0時的酶活最低，為最高酶活的16.5%。CDM12蛋白酶的最適反應pH為7.0～9.0(p>0.05)。pH 6.0時的酶活為最高酶活的60.1%；pH 11.0時的酶活最低，為最高酶活的42.4%。總的來說，CDM10的胞外蛋白酶比CDM12的蛋白酶對pH的變化更敏感。

圖3　CDM10和CDM12蛋白酶的最適反應pHFig.3　The optimum pH for protease activities ofCDM10 and CDM12

2.2.3最適反應NaCl濃度與鹽度穩定性

從圖4可以看出，CDM10和CDM12的蛋白酶在0.0～3.0 mol/L NaCl濃度范圍內均具有催化活力，隨著NaCl濃度升高，酶活先升高后下降。CDM10蛋白酶的最適反應NaCl濃度為1.5 mol/L，在1.0～2.0 mol/L NaCl濃度范圍內具有較高活性(最高酶活的80%以上)。NaCl濃度為0.0 mol/L時的酶活為最高酶活的60.6%，NaCl濃度為3.0 mol/L時的活性為最高活性的48.0%。CDM12蛋白酶的最適反應NaCl濃度為1.5～2.5 mol/L(p>0.05)，在1.0～3.0 mol/L NaCl濃度范圍內均具有較高活性(最高酶活的80%以上)。NaCl濃度為0.0 mol/L時的酶活為最高酶活的45.4%。因此，CDM10和CDM12的蛋白酶具有較廣的鹽濃度適應性。

圖4　CDM10和CDM12蛋白酶的最適反應NaCl濃度Fig.4　The optimum NaCl concentration for proteaseactivities of CDM10 and CDM12

從圖5可以看出，CDM10和CDM12的胞外蛋白酶在0.0、1.0、2.0、3.0 mol/L NaCl中均具有良好的穩定性(p>0.05)，暗示其對低鹽和高鹽濃度均有較好的耐受性。普通蛋白質在高鹽環境中會發生鹽析沉淀從而變性失活，嗜鹽古菌蛋白質獨特的結構特征使得能夠在高鹽環境中發揮活性，即主要通過增加表面酸性氨基酸殘基的比例以形成負電屏蔽，從而在蛋白周圍形成一層水化層來維持高鹽環境中的活性和穩定性[14]。然而，目前報道的很多嗜鹽古菌胞外蛋白酶，如HalogeometricumborinquenseTSS101[15]、Natronococcusoccultus[16]的胞外蛋白酶，僅在高鹽濃度下具有活性，在低鹽濃度下會失活。CDM10和CDM12蛋白酶廣泛的鹽濃度適應性將使其在高鹽或低鹽工業中均能發揮作用。

圖5　不同NaCl濃度處理對CDM10(a)和CDM12(b)蛋白酶活力的影響Fig.5　Effect of pre-incubation at different NaCl concentrationson protease activities of CDM10 (a) and CDM12 (b)

2.2.4抑制劑對蛋白酶活性的影響

根據活性中心的功能基團，蛋白酶主要分為天冬氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶[17]。為了探究CDM10和CDM12胞外蛋白酶種類，分別測定不同的蛋白酶抑制劑對胞外蛋白酶酶活的影響。從圖6可以看出，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF使CDM10和CDM12胞外蛋白酶活性分別降低了94.4%和90.7%。

圖6　抑制劑對CDM10(a)和CDM12(b)蛋白酶活力的影響Fig.6　Effect of inhibitors on protease activities ofCDM10 (a) and CDM12 (b)

半胱氨酸蛋白酶抑制劑PCMB使CDM10和CDM12胞外蛋白酶活力分別降低了47.0%和65.9%。金屬蛋白酶抑制劑EDTA可能通過螯合金屬離子使酶活性中心失去輔因子從而使CDM10和CDM12胞外蛋白酶活力分別降低了33.0%和60.4%。天冬氨酸蛋白酶抑制劑pepstatin A對酶活沒有顯著影響(p>0.05)。這些結果表明CDM10和CDM12的胞外蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，半胱氨酸和金屬離子對于蛋白酶活性的發揮具有重要的作用。

3　結論

本研究從分離自內蒙古柴達敏鹽湖的39株嗜鹽古菌中篩選出8株產胞外蛋白酶菌株，16S rRNA基因序列分析表明其中7株可能為新的分類單元，暗示著我國高鹽環境中蘊藏著豐富的嗜鹽古菌蛋白酶資源。CDM10和CDM12產蛋白酶能力最強，其蛋白酶具有良好的熱穩定性，對低鹽和高鹽濃度均有較好的耐受性，因而具有廣泛的應用前景。嗜鹽古菌蛋白酶酶學特性的研究能夠為其在工業技術領域的應用奠定基礎。

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