南極磷蝦微生物復合發酵制備呈味基料的工藝優化

章雪琴，吉宏武,2,3,4*，張迪，段偉文，劉書成,2,3,4

1(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江，524088) 2(廣東省水產品加工重點實驗室，廣東 湛江，524088) 3(廣東省海洋食品工程技術研究中心，廣東 湛江，524088)4(廣東省普通高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東 湛江，524088)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)又稱南極大磷蝦，是一種生活在南極洲水域的海洋浮游甲殼類生物，資源豐富，據統計全球資源總量至少有6.5～10億噸[1]。此外，南極磷蝦的降解產物含有豐富的游離氨基酸、肽類、核苷酸等物質[2]，既具有營養保健功能又是良好的呈味物質。其富含的氨基酸包含人體所需的全部必需氨基酸，有些還具有很好的呈味效果，比如帶有甜味的甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、丙氨酸，帶有鮮味的天冬氨酸、谷氨酸等，還含有一些既能提供鮮味又可以調節人體生理機能的短肽，既是天然的鮮味成分，又具有良好保健作用的核苷酸、肌苷酸、鳥苷酸等物質[3]。因此南極磷蝦是制備功能性天然海鮮調味料的理想原料。

微生物發酵法是一種制備調味料的方法，廣泛用于味精、醬油、醋等調味品的制備，在改善香腸、魚露、泡菜風味等方面也有重要作用。用于食品發酵的微生物種類繁多，多采用混合發酵的方式，可以有效地去腥脫苦，改善風味，縮短發酵時間，彌補單一菌種發酵的缺陷[4-6]。NURMI[7]發現在生產香腸的過程中，使用乳酸桿菌和微球菌混合發酵與單一菌種發酵相比，不僅產酸更快而且明顯縮短了發酵時間，提高了風味質量。此后，混合菌種發酵劑的使用得到快速的發展。NATTEEWAN UDOMSIL[8]利用TetragenococcushalophilusMS33和Virgibacillussp. SK37兩種菌進行復合發酵，縮短了魚露的發酵時間，提高了氨基酸含量，減少胺類物質的生成，提高了產品的整體接受性。孟凌玉[9]以木糖葡萄球菌、戊糖片球菌、枯草桿菌對蝦的酶解液進行混合發酵，所得產品發酵程度高，發酵液蝦味明顯，彌補了單一菌種發酵的不足，但是發酵周期較長，香味不夠濃郁。本研究在此基礎上引入了植物乳酸桿菌和魯氏酵母菌，直接鹽漬后進行半固體發酵。植物乳酸桿菌是發酵過程中的優勢菌，分解糖產生乳酸，可降低發酵產物的pH值，抑制大多數腐敗菌及致病菌的生長，而魯氏酵母是典型的產香型菌株，其產生的乙醇與植物乳酸桿菌產生的乳酸作用生成酯類，可顯著提高產品的香氣指數[10]，所得產品的風味更好。

本實驗采用模糊數學綜合評價結合響應面分析的方法，優化南極磷蝦復合發酵的最佳工藝參數，開發一種既營養又美味的天然海鮮調味料，促進南極磷蝦的進一步利用。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

南極磷蝦(Euphausiasuperba)：2017年5月購自中國水產有限公司，-40 ℃凍藏；風味蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司；木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus，菌種編號GIMI.895)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，菌種編號GIMI.191)和魯氏酵母菌(Saccharomycesrouxii，菌種編號AS2.180))：中國科學院菌種保藏中心；MRS培養基 、營養瓊脂(NA)、麥芽汁瓊脂培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。

PHST-3F 型酸度計，上海雷磁儀廠; GL-10LND 型離心機，上海安亭科學儀器廠; LDZX-50KBS 型立式蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；HZQ-X100全溫振蕩培養箱，蘇州市培英實驗設備有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1測定方法

氨基酸態氮：采用甲醛滴定法 (GB 5009.235—2016)。

1.2.2工藝流程

南極磷蝦→切碎→腌制→打漿→發酵→酶解→滅酶→成品

1.2.3操作要點

南極磷蝦實驗用量為100 g，解凍后切碎；加7%食鹽腌制2 h；加1倍水打漿；發酵完成后按0.1%的比例加入風味蛋白酶，50 ℃酶解3 h，滅酶，取上清液，備用。

1.2.4制備菌液

首先將木糖葡萄球菌、植物乳酸桿菌、魯氏酵母菌分別接種到營養瓊脂、MRS培養基、麥芽汁瓊脂培養基中活化2次，然后在液體培養基中擴大培養，木糖葡萄球菌、植物乳酸桿菌菌液在振蕩培養箱中以80 r/min、37℃培養24 h，魯氏酵母菌菌液以100 r/min、28 ℃培養48h。最后4 ℃ 3 500 r/min 離心15 min 收集菌體，重懸在 0.85 %無菌生理鹽水中，采用平板計數法調整菌懸液菌體濃度為108CFU/mL，備用。

1.2.5實驗設計

1.2.5.1單因素實驗

以感官評分和氨基態氮含量為指標，首先確定菌種比例，然后初步篩選出影響發酵液品質的發酵溫度、發酵時間、接種量3個主要因素的最佳條件。發酵時間：15、18、21、24、27 h, 控制發酵溫度30 ℃，接種量4%；發酵溫度：22、26、30、34、38 ℃，控制發酵時間21 h，接種量4%；接種量：1%、2%、3%、4%、5%、6%，控制發酵溫度30 ℃，發酵時間21 h。

1.2.5.2響應面優化實驗

以單因素實驗結果為依據(未顯示)，以發酵溫度(A)、接種量(B)、發酵時間(C)為自變量，綜合感官評分為響應值，設計3因素3水平的Box-Behnken試驗，試驗因素和水平見表1。

表1　Box-Behnken實驗因素與水平編碼Table 1　Factors and levers of Box-Behnken test

1.2.5.3感官評定方法

參照IRENEUSZ BIALOBRZEWSKI[13]的方法, 由10位感官評定人員對樣品進行打分。評定前，使每個評定員對樣品的蝦味、發酵味、異味、鮮味、口感有明確的了解。然后按感官評分標準表(見表 2)進行評分。

表2　南極磷蝦發酵液感官評定標準表Table 2　Standard of sensory evaluation for Antarctic krill fermentation broth

1.2.6建立模糊數學模型

1.2.6.1確立因素集

因素集 U，影響被評判對象感官質量的屬性或性能的集合。本實驗以氣味(u1)、色澤(u2)、形態(u3)、滋味(u4)這4個感官評價指標組成因素集,即U ={u1，u2，u3，u4}。

1.2.6.2確立評語集

評語集 V，反映被評判對象質量等級的集合。將南極磷蝦發酵液的感官質量劃分為4個等級，即優秀(v1)、良好(v2)、一般(v3)、較差(v4)，V={ v1，v2，v3，v4}，每個等級相對應的分值見表2。

1.2.6.3確定質量因素權重集

權重集 K，影響樣品質量的各個因素在被評定因素中所處的地位即權重系數的集合，每個質量因素對應一個權重系數，本實驗中 K={氣味 k1,色澤 k2,形態 k3,滋味k4}，且 k1+ k2+ k3+ k4=1。

1.2.6.4確立模糊關系綜合評判集

對樣品的每個質量因素進行評價打分，統計各質量因素在各等級中的票數，將各等級的票數除以總人數得到樣品的質量評價模糊關系矩陣A。各樣品的模糊數學綜合評判集 Y = K × A。

1.3　數據處理與統計

每個試驗重復驗3次，用 Origin 8.5、Microsoft Excel 2003 和Design Expert8.0.5軟件進行數據處理和統計分析，結果用“平均值±標準差”表示。

2　結果與討論

2.1　發酵液質量因素的權重分布情況

采用用戶調查法[12]，由10 名感官評價員對氣味、色澤、形態、滋味4個因素按重要程度打分，總分 10分。統計所有打分，將各因素的得分之和除以總分100分，即得各因素的權重因子。

由表3可知，對發酵液感官品質按重要程度排序，即氣味>滋味>色澤>形態，K={氣味，色澤，形態，滋味}={0.39，0.185，0.155，0.27}。

表3　評價南極磷蝦發酵液風味質量因素的權重分布統計Table 3　Weight distribution and statistics of Antarctickrill fermentation broth’ quality factor

2.2　響應面優化實驗結果與分析

2.2.1模糊數學感官評定結果

10位感官評定人員分別對17組樣品的氣味、色澤、形態、滋味按評價標準進行感官評價。統計每個指標在各等級中的票數，得出南極磷蝦復合發酵感官評定結果，見表4。

表4　不同發酵反應條件下感官評定票數分布Table 4　Vote distribution of sensory evaluation of fermentation under different conditions

注: vl: 優秀; v2: 良好; v3: —般; v4: 較差。

2.2.2模糊矩陣的建立及結果

以樣品1中的氣味指標為例，從表4可知，有0人認為樣品的氣味處于優秀等級，有3人認為其氣味良好，5人認為氣味一般，2人認為較差, 樣品1的氣味因素在各等級的評定人數除以總評定人數10，可得A氣味=[0，0.3，0.5，0.2]，同理A色澤=[0.1，0.5，0.3，0.1]。將影響感官評定的4個因素的評價結果轉化為模糊關系矩陣,可得：

2.2.3模糊變換及綜合評價結果

將權重集K乘以模糊關系矩陣A即可得到樣品的綜合評價結果Y。同樣以1號樣品為例。

同理可得另外16組樣品的綜合評價結果：

Y2=(0.4515，0.389，0.1595，0)；

Y3=(0.119，0.4915，0.3505，0.039)

Y4=(0.2665，0.402，0.2535，0.078)；

Y5=(0.253，0.4035，0.2775，0.066)

Y6=(0.208，0.435，0.213，0.144)；

Y7=(0.4035，0.4135，0.183，0)

Y8=(0.47，0.413，0.117，0) ；

Y9=(0.253，0.529，0.218，0)

Y10=(0.184，0.4845，0.2925，0.039)；

Y11=(0.2875，0.41，0.2755，0.027)

Y12=(0.185，0.5185，0.215，0.0815)；

Y13=(0.3785，0.4775，0.144，0)

Y14=(0.3125，0.3725，0.198，0.117) ；

Y15=(0.262，0.388，0.323，0.027)

Y16=(0.287，0.542，0.171，0)；

Y17=(0.253，0.5，0.247，0)

2.2.4Box-Behnken試驗設計結果與分析

為了更好地比較各樣品之間的優劣，防止信息缺失，將模糊向量單值化，便于綜合比較[13]。將優秀、良好、一般、較差4 個等級按次序賦予 5、4，3、2分，將綜合評分結果中各個量分別乘以其相對應的分值，其和作為每個產品的最終感官評定總分T，結果見表5。

2.2.4.1二次回歸擬合及方差分析

以感官評定總分為響應值，使用Design Expert 8.0.5軟件對以上試驗結果進行回歸分析，確定南極磷蝦發酵液感官評定總分(Y)對發酵溫度(A)、發酵劑接種量(B)、發酵時間(C)的二次多元回歸方程，去除不顯著項，得到回歸方程：

Y=4.25+0.17A-0.074B+0.09C-0.16AC-0.34A2-0.25B2-0.01C2

表5　Box-Behnken試驗設計結果Table 5　Design and results of Box-Behnken

為了檢驗該模型的可靠性和各因素對感官評分的影響，對回歸模型和回歸系數進行方差分析。由表6可知，該模型極顯著(p<0.000 1)，失擬項不顯著(p=0.925 3>0.05)，說明此模型高度顯著可靠，未知因素對試驗結果的干擾很小，擬合程度好；相關系數R2=0.974 6，說明模型響應值即感官評分的變化97.46%來自所選因變量，試驗誤差小，可以很好的反映感官評分與發酵溫度、發酵時間和接種量之間的關系[14]。回歸方程各項方差分析表明，一次項A、C和交互項AC以及二次項A2、B2、C2對感官評分影響極顯著，一次項B對感官評分影響顯著，說明各因素之間不是簡單的線性關系，而是呈二次關系，響應值的變化比較復雜。由F值可知，各因素對感官評分的影響順序依次為：A(發酵溫度)>B(發酵時間)>C(接種量)。綜上所述，使用該模型能夠較好對感官評分進行分析和預測，確定最佳發酵工藝參數。

2.2.4.2響應面與等高線結果分析

圖1～圖3是發酵溫度、接種量、發酵時間與相對應的響應值構成的三維空間趨勢圖，可以直觀地反映3因素交互作用對感官評分的影響。從等高線的形狀可以看出各因素交互作用的強弱，圓形表示交互作用不顯著，橢圓表示交互作用顯著；從響應曲面的坡度可以反映因素值的變化對響應值的影響大小，坡度陡峭說明因素值的變化對響應值的影響較大，坡度平緩說明因素值的變化對響應值的影響較小[15]。因此，從圖可以看出，AC項的交互作用對感官評分的影響最顯著，其次是AB、BC交互項，這與連鑫[10]優化蝦醬發酵工藝的結果類似。從圖2可知，當發酵時間固定在零水平時，隨著溫度升高，感官評分先迅速增加，達到一個最大值后緩慢下降，變化趨勢較大，說明溫度的變化對感官評分的影響很大；當固定溫度時，感官評分隨著發酵時間變長先增加后下降，時間的變化對感官評分也具有很大影響。等高線圖呈現橢圓形，說明發酵時間和發酵溫度的交互作用對感官評分具有顯著影響。響應曲面有最高點即感官評分有最大值，說明發酵溫度和發酵時間過高或過低都不能使感官評分達到最大，只有取其中某個適當值才能使感官評分最大。圖1和圖3的變化趨勢與圖2基本類似。

表6　回歸模型方差分析Table 6　Variance analysis of fitted model

注：*表示影響顯著(p<0.05)，**表示影響極顯著(p<0.01)。

圖中感官評分隨各因素的變化呈現先上升后下降的趨勢，可能是因為當發酵溫度過高時，超過微生物的最適生長溫度，代謝活動降低，對腐敗微生物的抑制作用減弱，產生不良氣味，致使感官評分下降；而溫度過低時，微生物生長受到限制，發酵緩慢，鮮味不足，所以發酵溫度在30～32 ℃時發酵液感官評分比較高，此結果與XU YAN-SHUN[18]探究發酵溫度對銀鯉香腸的品質影響的變化趨勢一致。當接種量過高時，隨著乳酸菌和酵母菌的增加，會發酵過度，產生酸敗味、酒精味，發酵液香氣不純；接種量較低時，發酵味不明顯，所以接種量在3%～4%比較合適，FRANCISCO CARRAU[17]等人在探究釀酒酵母接種量對酒香氣成分的影響中也證實只有適當的接種量，才能使酒的香味最好；葉勁松[18]在研究發酵時間對發酵豬耳西式火腿品質的影響中也表明發酵時間的選擇對產品的質量至關重要，發酵時間太長會使代謝產物積累，產生不良風味；發酵時間太短，微生物和酶沒有充分發揮作用，生成的風味物質種類單一，特征風味不夠明顯，所以發酵時間在22～24 h時，發酵液感官評分比較高。從而也說明這個模型可以很好的反映感官評分和這3個因素的關系。

2.2.4.3驗證實驗結果

利用Design Expert軟件對回歸方程進行分析，得到南極磷蝦復合發酵的最佳工藝條件為：發酵溫度30.71 ℃，發酵時間21.71 h，接種量3.87%，感官評分的預測值為4.28，結合實際，選用發酵溫度為31 ℃，發酵時間22 h，接種量4%為最佳條件。為了檢測模型預測結果的可靠性，在最優條件下進行3次驗證實驗，實際測得的感官評分為4.39±0.061，與預測值之間的相對誤差為2.57%，誤差較小，說明該模型可以準確預測南極磷蝦發酵液的感官評分。

圖1　發酵溫度和接種量對感官評分影響的響應曲面(左)和等高線 (右)Fig.1　The suiface plot(left) and contour plot(right) for effectsof fermentation time and inoculums on the sensory score

圖2　發酵溫度和發酵時間對感官評分影響的響應曲面(左)和等高線 (右)Fig.2　The suiface plot(left) and contour plot(right) for effectsof fermentation time and temperature on the sensory score

圖3　發酵時間和接種量對感官評分影響的響應曲面(左)和等高線 (右)Fig.3　The suiface plot(left) and contour plot(right) for effectsof fermentation time and inoculums on the sensory score

3　結論

以南極磷蝦為原料，按木糖葡萄球菌∶植物乳酸桿菌∶魯氏酵母菌=1∶2∶3的比例進行混合發酵，通過模糊感官評價及響應面分析，得到發酵的最佳工藝條件為發酵溫度31 ℃，發酵時間21 h, 接種量4%，此條件下，不僅保留了蝦的鮮味，同時增加了特殊的發酵香味，得到的產品不僅營養豐富，而且風味飽滿、口感協調，促進了南極磷蝦的進一步開發利用。

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