大豆蛋白澄清劑對‘赤霞珠’干紅葡萄酒品質的影響

2018-04-12 09:52:08魯榕榕馬騰臻張波AntonioMorata祝霞韓舜愈

食品與發酵工業 2018年3期

魯榕榕，馬騰臻，張波，Antonio Morata，祝霞，韓舜愈*

1(甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點試驗室，甘肅省葡萄與葡萄酒產業技術研發中心，甘肅蘭州，730070)2(馬德里理工大學高等農業工程技術學院化學與食品技術系，西班牙馬德里)

澄澈外觀、良好色澤及協調香氣是優質紅葡萄酒重要的感官品質。新釀制的葡萄酒中含有多酚、蛋白質等大分子物質，酒體渾濁或極不穩定，下膠澄清是指通過加入能夠迅速沉降這些懸浮物的物質，使酒體在短時間內達到較好澄清度及穩定性的工藝操作[1-2]。常用的下膠材料主要分為天然凝膠、蛋白類下膠劑(包括動物和植物蛋白)和化學合成下膠劑三類[2]。皂土是最常用的天然凝膠下膠澄清劑，其澄清效果較好，但會與紅葡萄酒中色素及香氣物質結合，從而嚴重影響酒體色澤及風味品質，且使用前需提前用溫水浸泡，處理后會使酒體產生大量酒腳，不便于生產操作[3]；化學合成的下膠澄清劑PVPP和酪蛋白酸鉀等易溶解、使用方便，且PVPP可除去紅葡萄酒中的劣質單寧，改善其感官品質，但也會對紅葡萄酒的色澤有較大影響[4]；酪蛋白和明膠作為常用的動物蛋白類下膠澄清劑，能夠與紅葡萄酒中的單寧結合，降低酒體收斂性，提高柔和度，且對品質影響較小，但其可能會引起一些特殊人群的過敏反應，存在一定的安全隱患[4]。

植物蛋白類下膠澄清劑能夠在很大程度上彌補傳統澄清劑的這些缺陷，研究表明其在保證下膠質量的同時，對葡萄酒色澤及香氣品質影響較小，具有較高安全性，還可用于嚴格素食主義者葡萄酒的生產[3, 5-6]。目前，已有部分學者對谷朊蛋白在葡萄酒中的應用進行了評價，如GONZáLEZ[7]研究了皂土、明膠、卵清蛋白和谷朊蛋白對新釀制和陳釀的紅葡萄酒色澤及色素成分的影響，表明谷朊蛋白在新酒中的澄清效果優于動物蛋白，且其對酒樣色澤品質影響較小；屈慧鴿[8]等關于‘蛇龍珠’干紅葡萄酒的研究表明，谷朊蛋白具有較好的澄清效應，但過量添加會導致葡萄酒品質下降；然而HISCHENHUBER[9]研究發現谷朊蛋白可能會引起食物過敏和腹腔疾病等不良反應。

植物蛋白來源廣泛、種類繁多，具有較大應用潛力，但目前報道的可用于葡萄酒下膠澄清的植物蛋白還較少，有待進一步開發。GRANATO等[5]研究了豆類蛋白(大豆蛋白、豌豆蛋白、扁豆蛋白)和谷朊蛋白4種植物蛋白澄清劑對白葡萄酒澄清效果的影響，結果表明大豆蛋白澄清效果不亞于谷朊蛋白，且對原花色素含量的影響較小，可用于白葡萄酒的澄清處理，但有關其在紅葡萄酒中的應用以及對酒體色澤和香氣品質影響的研究較少。

同國外優質紅葡萄酒相比，我國西部產區存在醇香不足、色度較淺、色澤老化快等問題，這也是多年來一直制約當地干紅葡萄酒品質提升的關鍵問題之一。因此，如何通過下膠澄清劑或澄清工藝的改良，減少生產過程中色素及香氣成分的損失在實際生產中具有重要意義。本試驗以甘肅農業大學自產的‘赤霞珠’干紅葡萄酒作為試材，比較皂土、明膠、酪蛋白、大豆蛋白和聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)5種不同類型澄清劑的澄清效果及其對酒樣基本指標、顏色、酚類物質及揮發性香氣的影響，以期為紅葡萄酒品質的調控與新型下膠澄清劑的推廣應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

‘赤霞珠’葡萄于2015年采自甘肅農業大學葡萄種植基地，含糖量約為20.3～21.0 °Brix，并于2016年進行釀制。

釀酒酵母[紅佳釀 Vintage Red(VR)]，意大利Enartis公司；大豆蛋白、皂土、酒酒球菌(OMEGA)、果膠酶(Cuvee Blanc)，法國Lallemand公司；酪蛋白、福林酚、2-辛醇(色譜純)，美國Sigma公司；明膠、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、磷鉬鎢酸顯色劑及無水葡萄糖、一水合沒食子酸等常規試劑，天津市光復精細化工研究所；費林試劑、次甲基藍指示劑及酚酞指示劑等均按GB/T 603—2002.《化學試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備》進行配制。

1.2　儀器與設備

TRACE 1310氣象色譜-質譜聯用儀、ISQ型單四級桿質譜儀、Genesis 10S型紫外-可見分光光度儀，美國Thermo Scientific公司；色譜柱DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)，美國Agilent Technologies公司；固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)裝置、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅(divinylbenzene/carboxen/polydimethyl-siloxane，DVB/CAR/PDMS)萃取頭，美國Surpelco公司；CP 214型電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；DF-II集熱式恒溫磁力攪拌器，金壇市恒豐儀器制造有限公司；160350D型沸點測定儀，法國DujardinSalleron公司；BCD-539WF型冰箱，青島海爾股份有限公司；18100摩爾超純水機，重慶摩爾水處理設備有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋，金壇市恒豐儀器制造有限公司。

1.3　方法

1.3.1葡萄酒釀制

篩選適量品質較好且成熟度一致的‘赤霞珠’葡萄除梗破碎，添加50 mg/L SO2(以偏重亞硫酸鈉形式)及200 mg/L果膠酶，低溫浸漬48 h后，接種0.2 g/L釀酒酵母并于25～28 ℃下進行酒精發酵，至殘糖低于4 g/L皮渣分離終止發酵(發酵時間約為12 d)，然后接種0.02 g/L酒酒球菌進行蘋果酸-乳酸發酵(15～18 ℃，約14 d)，蘋果酸低于0.5 g/L即完成發酵，進行兩次倒罐去酒泥后，酒樣在低溫下密封貯存備用。

1.3.2下膠澄清試驗

皂土和明膠用適量溫水配制成100 g/L的溶液，浸泡膨脹12 h后，攪拌均勻備用；大豆蛋白、酪蛋白和PVPP則直接配制成100 g/L的溶液，用200 mg/L SO2保存備用[10]。

將酒樣分裝于250 mL透明玻璃瓶中，加入5種下膠澄清劑母液并調整其濃度統一分別為100、200、300 mg/L(通過預試驗確定5種下膠澄清劑相同的有效濃度范圍[10-11])，以自然澄清酒樣作為對照，室溫下避光靜置兩周后，記錄瓶底酒泥厚度并進行相關檢測，每個處理重復3次。

1.3.3基本指標測定

總酸：采用酸堿滴定法[12]，結果以酒石酸(g/L)計。

揮發酸：室溫下，用特制蒸餾裝置蒸餾10 mL酒樣，收集餾出液以后，采用酸堿滴定法進行測定[12]，結果以乙酸(g/L)計。

總糖：采用斐林試劑法[12]，結果以葡萄糖(g/L)計。

酒精度：采用沸點測定儀測定。

透光率：利用紫外-可見分光光度計檢測酒樣在波長為680 nm處的透光率，以蒸餾水為對照[1]。

色度、色調：參照SIMONATO[13]方法，酒樣用相同pH值的緩沖溶液稀釋5倍后，分別測定其在波長為420、520、620 nm處的吸光度值，即A1、A2、A3，三者之和為酒樣色度，前兩者之比為色調。

單寧：參照NY/T 1600—2008 《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測定：分光光度法》[14](y=0.118 8x-0.000 7，R2=0.999 1)。

總酚：采用FOLIN-CIOCALTEN比色法[15]測定。將1 mL酒樣用蒸餾水稀至100 mL后，取1 mL樣品溶液加入蒸餾水5 mL、1 mol/L的FOLIN-CIOCALTEN顯色劑1 mL和7.5%的Na2CO3溶液3 mL進行顯色，靜置2 h后，在765 nm波長處測定樣品吸光度，再根據標準曲線方程(y=0.102 4x-0.005 8，R2=0.999 3)計算總酚含量。

花色苷：參照CHRIS[16]方法。取適量酒樣于4 ℃，5 000 r/min離心10 min，然后進行后續操作。(1)用緩沖液將酒樣稀釋10倍后，測其在520 nm處吸光度，記為A520；(2)取100 μL酒樣，加10 mL 1 mol/L的鹽酸溶液，室溫靜置3～4 h后，測其在520 nm處吸光度，記為A520-H；(3)取2 mL酒樣，加100 μL 6% 的NaHSO3溶液，混勻后立即測其在520 nm處吸光度，記為A520-S。總花色苷、單體花色苷、聚合花色苷和顯色花色苷的含量分別按公式(1)、(2)、(3)、(4)進行計算：

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

柔和指數：參照張佳濤[17]方法，按公式(8)計算：

S=A-(T+C)

(8)

式中：S，樣品柔和指數；A，乙醇體積分數，%；T，總酸含量，g/L；C，單寧含量，g/L。

蛋白質含量：采用考馬斯亮藍法[18]測定。取適量酒樣離心，取1 mL上清液，加5 mL考馬斯亮蘭G250試劑，充分混合放置2 min后，于595 nm處測量吸光度，記錄并通過標準曲線獲得酒樣中蛋白含量。

蛋白穩定性：參照POCOCK[19]方法，取200 mL經0.45 μm膜過濾酒樣于80 ℃恒溫水浴6 h后，4 ℃恒溫冷卻12 h，然后分別測定540 nm處加熱前與冷卻后的吸光度，若兩者差值≤0.02，則樣品穩定。

1.3.4揮發性香氣成分的測定

1.3.4.1香氣富集

取8 mL酒樣于15 mL樣品瓶中，加入2 g NaCl和100 μL內標2-辛醇(濃度為1.664 mg/L)，加轉子密封，置于磁力攪拌器上，40 ℃下水浴平衡30 min后頂空萃取30 min。萃取結束后，取出萃取頭插入GC-MS聯用儀進行香氣檢測。

1.3.4.2GC-MS條件

參照陳霞[20]方法，并略作調整。

色譜條件：色譜柱：DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)；升溫程序：40 ℃保持7 min，以4 ℃/min升至200 ℃，保持8 min；載氣(He)流速1 mL/min；進樣口溫度240 ℃；不分流進樣。

質譜條件：電子轟擊離子源(EI)；電子能量70 eV；傳輸線溫度220 ℃；離子源溫度240 ℃；質譜掃描范圍m/z50～350。

1.3.4.3香氣成分分析

定性分析：采用保留指數(RI)和NIST-11、Wiley及香精香料譜庫檢索比對進行定性，譜庫比對時要求匹配度大于800。

定量分析：采用內標法進行半定量分析，內標為2-辛醇。計算公式[21]如下：

(9)

式中：X，香氣物質的質量濃度，mg/L；f，內標物的校正因子，f=1；A，測得香氣物質的峰面積；c，內標物的質量濃度，mg/L；A0，測得內標物的峰面積。

1.4　數據處理

利用Microsoft Office Excel 2013對樣本(n=3)所得數據進行基本處理，IBM SPSS Statistics 19.0分析軟件進行數據的統計分析。其中，采用多因素方差分析(Duncan法)(p<0.05)進行數據的差異顯著性分析，并對不同處理酒樣的香氣化合物進行主成分分析。

2　結果與分析

2.1　澄清劑對紅葡萄酒澄清效果及基本指標的影響

2.1.1澄清效果

圖1表示不同下膠澄清處理后酒樣透光率變化及其酒腳厚度。如圖所示，與對照相比，下膠澄清后大多數酒樣的澄清度顯著提高(p<0.05)，且隨澄清劑用量的增加，澄清度呈上升趨勢(大豆蛋白除外)，但酒腳厚度也逐漸增加。圖1-A中，透光率達到91%以上的酒樣包括200 mg/L和300 mg/L的PVPP、大豆蛋白和明膠處理組。其中，PVPP 300 mg/L和大豆蛋白200 mg/L 處理酒樣的透光率較高，200 mg/L和300 mg/L明膠處理組次之，且兩者無顯著差異(p>0.05)；但300 mg/L PVPP會使酒體產生大量酒腳，不利于后續生產操作。此外，100 mg/L的皂土和酪蛋白幾乎無澄清作用，但當用量為200 mg/L時，酒樣澄清度顯著提高，且300 mg/L皂土處理組澄清度顯著高于200 mg/L，而200 mg/L和300 mg/L的酪蛋白處理酒樣無顯著差異(p>0.05)。

2.2.2澄清劑對酒樣基本指標的影響

由表1可知，與對照相比，除B1、P3、S1和S2處理組酒精度有所降低(降低0.16%～0.24%)，其他酒樣無顯著變化，說明澄清劑對酒精度幾乎無影響。經下膠澄清處理酒樣的總酸和總糖含量分別降低-0.01～0.12 g/L和0～0.45 g/L，揮發酸含量上升0～0.06 g/L，但大多數酒樣與對照差異不顯著。其中，酪蛋白處理酒樣的總酸含量顯著降低(降低5.62%～6.82%)，而明膠對總糖有較大影響(降低11.47 %～22.73%)。不同澄清劑對葡萄酒的柔和度有不同影響，其中B2、B3和L3處理酒樣的柔和指數顯著提高，而S1處理組則顯著下降(p<0.05)。此外，蛋白類澄清劑(酪蛋白、大豆蛋白和明膠)處理酒樣中，蛋白殘留量與對照組差異不顯著，未超過葡萄酒中蛋白允許最大量[3]，且酒體蛋白穩定性也未受到顯著影響(明膠300 mg/L除外)；而皂土會顯著降低酒樣中蛋白質含量(p<0.05)，從而提高其穩定性(表1)。

表1　各處理酒樣的基本指標Table 1　Basic indexes of different fined sample wine

注：處理列中B、C、P、S、G、CK分別表示皂土、酪蛋白、PVPP、大豆蛋白、明膠處理組及對照組，1、2、3分別表示用量為100、200、300 mg/L；

表中同一指標內不同字母代表差異顯著，樣本量n=3，p< 0.05；下同。

2.2　澄清劑對紅葡萄酒色澤及酚類物質的影響

如表2，經下膠澄清處理酒樣的色度值均低于對照酒樣，且隨澄清劑濃度的增加呈遞減趨勢，尤其300 mg/L處理組色度顯著較低(降低12.75%～27.63%)。其中，PVPP、大豆蛋白和明膠處理酒樣的澄清度雖相對較高，但PVPP和明膠對酒樣色度影響較大(P3和G3與對照相比降低27.63%)，而大豆蛋白的影響相對較小(僅降低5.66%～12.75%)。此外，B3酒樣的色調值明顯上升，而其他處理組與對照差異不顯著(C3和P3除外，p>0.05)。

各處理酒樣的顏色變化主要與其多酚化合物變化有關。與對照相比，澄清處理酒樣的總酚含量均有所下降，且隨用量的增加而逐漸降低，尤其皂土處理組降低4.76%～13.94%(表2)。花色苷是與紅葡萄酒顏色相關的主要酚類物質，下膠澄清后酒樣中總花色苷與單體花色苷含量均有所降低，且隨澄清劑用量的增加呈下降趨勢(G3除外)。其中，C1和D1處理組的總花色苷僅減少4.38 mg/L和0.91 mg/L，PVPP和明膠處理組的總花色苷則下降較多(降低20.44～46.46 mg/L)，而B1、C1和S1酒樣中單體花色苷含量與對照相比反而有所上升。處理組聚合花色苷含量顯著低于對照組(p<0.05)，其中PVPP和明膠處理酒樣下降16.02%～39.68%。就顯色花色苷含量而言，澄清度較高的處理組(PVPP、大豆蛋白和明膠)低于澄清度較低處理組(皂土和酪蛋白)，其中， PVPP處理酒樣中顯色花色苷下降最多(P2和P3分別降低41.44%和37.31%)，而明膠和大豆蛋白對其影響相對較小(降低2.54%～14.47%)。此外，下膠澄清后酒樣中單寧含量也有所降低，尤其皂土處理酒樣中下降4.76%～30.20%，這也是其柔和指數顯著提高的原因。

表2　各處理酒樣的色度、色調及酚類物質含量Table 2　Color intensity, hue and content of phenolic compound in different fined sample wine

2.3　澄清劑對紅葡萄酒揮發性香氣的影響

2.3.1各處理酒樣香氣成分的GC-MS分析

結合以上分析結果，試驗采用HS-SPME-GC-MS法對200 mg/L處理酒樣的揮發性香氣化合物進行了檢測分析。如表3，共檢出85種香氣物質，包括24種酯類(約占香氣總量34.25%～38.94%)、29種醇類(45.84%～51.97%)、11種有機酸類(8.87%～10.84%)、9種萜烯類(2.30%～2.84%)、5種羰基類(0.59%～1.19%)及7種其他化合物(0.68%～1.07%)。不同處理酒樣的香氣物質種類及含量有所差異：與對照相比，處理組中均未檢出乙酸松油酯、乙酸苯乙酯和6-甲基辛烯，但額外檢出鄰甲酚；而皂土處理組香氣總量降低28.83%，大豆蛋白處理組則僅降低10.28%，其他酒樣介于兩者之間，其中PVPP和酪蛋白處理組差異不顯著(p>0.05)。

表3　各處理酒樣中揮發性香氣化合物的GC-MS分析Table 3　GC-MS analysis of volatile compounds in different fined sample wine

續表3

序號香氣化合物RI(DB-WAX)含量/(mg·L-1)對照對照大豆蛋白PVPP明膠酪蛋白皂土氣味描述72-己烯酸乙酯12450.43±0.040.36±0.020.35±0.070.39±0.050.36±0.070.45±0.058辛酸乙酯143425.81±0.52a25.47±1.12a23.12±0.06ab20.66±0.21b24.47±0.40a22.81±0.56ab果香、油脂味[23]9壬酸乙酯15301.27±0.081.13±0.061.15±0.15ndndnd哈密瓜、草莓香[24]10乳酸異戊酯15640.59±0.050.42±0.030.53±0.100.51±0.060.46±0.060.55±0.0911癸酸乙酯163817.53±0.19a16.51±1.80ab15.36±0.19bc10.60±1.02d16.51±0.45ab14.62±0.57c脂肪味、果香[24]12辛酸-3-甲基丁酯16570.69±0.030.63±0.070.65±0.100.25±0.090.47±0.030.58±0.0313乙酸松油酯16850.45±0.02ndndndndnd檸檬、薰衣草香[25]149-癸烯酸乙酯16976.12±0.22ab6.55±0.41a5.47±0.39b4.54±0.22c5.89±0.21ab5.90±0.51ab果香[22]15苯乙酸乙酯17450.10±0.02ndndndndnd蜂蜜香[20]16水楊酸甲酯17511.28±0.041.19±0.111.27±0.211.20±0.131.43±0.091.36±0.11冬青葉香[26]17乙酸苯乙酯18132.85±0.022.64±0.022.72±0.382.47±0.182.54±0.102.77±0.17玫瑰、茉莉花香[20]18月桂酸乙酯18414.01±0.03a4.06±0.55a4.02±0.13a3.94±0.21a2.96±0.26b2.91±0.22b甜香、蜂蠟香[22]19花生四烯酸甲酯

大豆蛋白澄清劑對‘赤霞珠’干紅葡萄酒品質的影響

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設備

1.3 方法

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 澄清劑對紅葡萄酒澄清效果及基本指標的影響

2.2 澄清劑對紅葡萄酒色澤及酚類物質的影響

2.3 澄清劑對紅葡萄酒揮發性香氣的影響