不同結晶結構淀粉的拉曼光譜分析

史苗苗，李丹，閆溢哲，劉延奇

(鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州，450002)

淀粉主要由直鏈淀粉和高度支化的支鏈淀粉構成，線性直鏈淀粉的結構通過α-(1→4)糖苷鍵形成，支鏈淀粉分子結構由α-(1→4)糖苷鍵形成主鍵，α-(1→6)糖苷鍵形成分支[1-2]。根據X-射線衍射圖譜，可將淀粉分為A型，B型，C型和V型。A型在15°、17°、18°、23°等處呈現明顯的衍射峰；B型在5.6°、17°、24°處有明顯的衍射峰；C型有天然的C型和由A型或B型轉化而得到，衍射峰包括了A型與B型的峰型；V型是直鏈淀粉和脂肪酸、乳化劑、醇類和碘等配體形成的復合物，在7.8°、12.5°和19.5°處有衍射峰，它是以單螺旋結構構成的，一般與其他晶型共生存在[3]。

拉曼光譜是一種散射光譜，通過拉曼散射峰的強度、位置來反映分子振動或轉動，分析化合物分子中不同的官能團或化學鍵，以此獲取化學物中分子結構的信息[4]。

淀粉結晶結構的不同是由于分子的排列方式和晶體取向不同[5]，對淀粉進行不同處理時，分子排列發生改變，晶體結構會改變，拉曼光譜也會出現相應變化，因此，拉曼光譜可以應用于淀粉晶體結構的研究[6-8]，SCHUSTER[9]等用α-淀粉酶和淀粉糖苷酶水解淀粉，研究糊化和水解過程中淀粉的拉曼譜圖特征；LIU[10]等研究了拉曼光譜在玉米淀粉結構及其結晶度計算中的應用；PICCININI[11]等使用近紅外傅里葉變換拉曼光譜來檢測面包屑的淀粉回生。目前，通過拉曼光譜對淀粉結構有了一定的了解，所以，可以利用其檢測原理對食品原料的某些特性進行進一步的研究。

本文以馬鈴薯淀粉為原料,通過酸解、重結晶等步驟制備酸解淀粉、B型微晶淀粉及V型淀粉-正癸醇/十二醇復合物，并運用PeakFit v4.12軟件對其拉曼光譜譜圖進行分析研究，為淀粉的改性提供理論基礎和實驗依據。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

馬鈴薯淀粉(食品級)，河南恒祥進出口有限公司；正癸醇(分析級)，阿拉丁生化科技股份有限公司；十二醇(分析級)，阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇(分析級)，天津市富宇精細化工有限公司；濃HCl(分析級)，開封市芳晶化學試劑有限公司；異丙酮：分析級，阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2　儀器與設備

Acton Spectra Pro500i 拉曼光譜儀,英國雷尼紹貿易有限公司；SHB-Ш 循環水式真空泵,鄭州長城科工貿有限公司；DZKW-D-2 數顯恒溫水浴鍋,北京光明醫療器械廠；YP6102 電子天平,上海光正醫療儀器有限公司；LG10-2.4A高速離心機,北京醫用離心機廠。

1.3　實驗方法

1.3.1淀粉的純化

稱量100 g天然馬鈴薯淀粉置于500 mL的三口燒杯中，加入200 mL異丙酮純溶液，上置冷凝管，加熱至沸騰后，回流30 min后，使用布氏漏斗進行減壓抽濾，濾餅用無水乙醇反復淋洗3～4次，收集濾餅，在室溫下晾干，得到純化淀粉。

1.3.2淀粉的酸解

使用1.3.1得到的純化淀粉制備酸解淀粉。將5.0 g馬鈴薯淀粉加入到100 mL 2.2 mol/L的HCl溶液中,配制成50 g/L的淀粉懸浮液,于35 ℃下進行酸解7 d,用砂芯漏斗減壓抽濾,除去回收酸溶液,濾餅用去離子水抽濾洗滌多次,至pH值為7,殘余的固體物質用乙醇和丙酮抽濾下淋洗2～4次,收集固體物質并在室溫晾干備用[12]。

1.3.3B-型微晶的制備

使用1.3.2制得的酸解淀粉制備B-型微晶淀粉。將100 mL蒸餾水加入5.0 g酸性淀粉中制成50 g/L的淀粉溶液，加熱至80 ℃使淀粉溶解，然后冷卻，離心，上清液在-18 ℃條件下冷凍12 h，之后在室溫條件下解凍。解凍后只剩下少量冰，殘留物立即過濾，用冰水洗滌，室溫條件下干燥，最終得到B型微晶淀粉[10]。

1.3.4淀粉-醇類復合物的制備

將2.00 g B型微晶淀粉添加到500 mL的三口瓶中，加入40 mL蒸餾水，使用磁力攪拌器加熱，溫度為135 ℃，轉速1 360 r/min，上接回流裝置，待沸騰5 min后，緩慢向沸騰溶液中滴加正癸醇-乙醇溶液(一定量正癸醇溶于一定體積無水乙醇中)，繼續加熱10 min，轉移到一定溫度的恒溫水浴槽中，封口靜置一段時間，然后緩慢冷卻至室溫，放置24 h。離心分離，用無水乙醇洗滌沉淀物，反復離心2次，得到白色沉淀物，冷凍干燥12 h，研磨，所得樣品即為直鏈淀粉-正癸醇復合物[13-14]。

直鏈淀粉-十二醇復合物的制備方法同1.3.4中直鏈淀粉-正癸醇復合物的制備方法，只需將正癸醇換成十二醇。

1.3.5樣品的X-射線(XRD)測試

取適量復合物樣品置于正方形托盤的圓形螺紋中(圓形直徑大小為約為10 cm，厚約為115 mm)，使用光滑的玻片壓平，用Burker D8型X射線衍射儀測定，所用波長為0.154 2 nm的單色Cu-Kα射線。測試條件為：管壓40 kV，管流30 mA，掃描區域5°～35°，采樣步寬0.02°，掃描方式為連續，重復次數為1。

1.3.6樣品的拉曼光譜測試

拉曼光譜測試采用英國Renishaw的Inviaplus型顯微共聚焦拉曼光譜，激發光源為半導體激為532 nm，激光功率為50 mW，20倍長焦物鏡背向散射測量模式，掃描次數20次，曝光時間為10 s。取少量樣品放入鋁杯中，使用100 mV的激光照射，在180°范圍內收集散射輻射，波數范圍為100～3 250 cm-1[15]。

1.3.7數據處理

利用Origin6.1作圖軟件對數據進行處理、繪圖。使用 PeakFit v4.12對數據進行分峰擬合處理。

2　結果與分析

2.1　淀粉樣品的XRD圖譜分析

圖1為馬鈴薯淀粉經過一系列不同處理后的X-射線衍射圖。可以看出,原淀粉、酸解淀粉和重結晶淀粉在5.9°、17.1°、22.3°、24.0°附近存在較強的衍射峰，屬于B型結構。d，e是B型微晶淀粉和正癸醇與十二醇的復合物，在7.8°、13.4°、20.9°處有尖銳的特征峰，呈現V型結構。淀粉的B型結構和V型結構的晶型存在較大的差異。

a-馬鈴薯原淀粉; b-酸解淀粉; c-B型淀粉;d-淀粉-正癸醇復合物; e-淀粉-十二醇復合物圖1　不同處理方式所得的馬鈴薯淀粉XRD圖Fig.1　X-ray diffraction pattern of starch

2.2　不同結晶結構淀粉樣品的拉曼圖譜解析

不同結晶結構的馬鈴薯淀粉拉曼光譜圖及圖譜分析見圖2和表1。可以看出，樣品出現的散射特征峰位置一致。從原淀粉到直鏈淀粉與正癸醇復合過程中，拉曼光譜特征峰強度逐步下降。其中，酸解過程中，峰強度變化非常大。原淀粉中含有大量的結晶結構，使得峰強度很高，酸解后，峰強度極大地降低，是因為在酸解過程中，很多無序排列結構被除去，分子變得有序，構象的數量減少，導致了峰強度的降低。其次，重結晶過程中，峰強度進一步降低，1 120 cm-1處的特征峰變緩，呈圓包凸出狀，近乎消失，是因為在這個過程中，有序的淀粉在熱水中加熱時，變得無序，然后冷卻時，無序的結構發生重結晶，再聚集成有序結構，2種有序結構是不同的，在這個過程中，水分滲出，結晶度增加，B型微晶形成，故兩者的拉曼光譜也表現出了較大的差異。這與前人[9]的研究結果一致。直鏈淀粉與正癸醇復合過程中，475.534、938.91、2 909.45 cm-1處的峰再次降低，這是非晶結構轉化成結晶結構的結果。此外，復合后，2 909.45 cm-1處的光譜波形不變，峰頂部變得狹窄，這是由于正癸醇分子進入單螺旋，與淀粉微晶復合。2種復合物的峰形基本一致，強度上相差較大，直鏈淀粉-十二醇復合物在2 909.45 cm-1處的峰強度達到17 800.70，而直鏈淀粉-正癸醇復合物的峰強度是8 099.46。在入射光相同的情況下，出現峰強度的差異，可能與配體的差異或不同的復合條件有關。從整體上看，不同晶型淀粉的結構有很大差異，這印證了X-衍射得到的結果。

a-馬鈴薯淀粉; b-酸解淀粉; c-B型微晶淀粉; d-直鏈淀粉-正癸醇復合物;e-直鏈淀粉-十二醇復合物圖2　不同結構淀粉的拉曼光譜與局部拉曼光譜Fig.2　Raman spectra and the local Raman spectra of starch

樣品特征衍射峰強度475.534cm-1938.91cm-11337.09cm-12909.45cm-1馬鈴薯淀粉12579.507913.758123.3833029.10酸解淀粉6005.333791.753955.4214902.70B型微晶淀粉3273.342253.031915.508378.17直鏈淀粉-正癸醇復合物2658.581790.692584.248099.46直鏈淀粉-十二醇復合物4961.624442.476485.2317800.70

不同結晶結構的馬鈴薯淀粉拉曼特征振動對比見表2。拉曼光譜中圖譜基線的高低對應于樣品中熒光性雜質的含量。從表2中可以看出，經過一系列不同的處理后，不同結構的拉曼光譜位置，除少數發生輕微偏移外，主要的散射特征峰基本無變化，特征峰強度逐步降低，這可能是由于淀粉的進一步提純導致，在每一步處理中，淀粉經過了蒸餾水和無水乙醇的多次洗滌，除去了大部分的熒光性雜質，使淀粉的基線不斷降低。淀粉-十二醇復合物各峰值強度增大，可能是由于配體不同。馬鈴薯原淀粉在815 cm-1處有峰，而其他3種消失。476.62 cm-1處的峰是由吡喃糖環中C—O—C的骨架振動和δ(C—C—O)引起，表示的是多糖的聚合度，是淀粉的特征峰[16]，峰強度比2 909.45 cm-1處C—H伸縮的峰強度低。861.84 cm-1處的峰來源于C—O—C環和C1—H彎曲振動，938.91 cm-1處是α-(1→4)糖苷鍵的C—O—C的彎曲振動引起[17-18]。

表2　不同結構淀粉的拉曼特征振動對比Table 2　Raman characteristic vibration of starch

注：a, b分別表示左偏移，右偏移；*表示該處光譜消失。

2.3　800～1 500 cm-1圖譜區淀粉結構分析

對不同處理后的淀粉樣品的吸收峰進行分峰,可以獲得淀粉的每個官能團的吸收峰及其峰面積。不同結構淀粉800～1 500 cm-1分峰圖譜見圖3。平滑度SM設定7.19%，基線誤差限tol設定3.0%，掃描放大值Amp設定1.50%，擬合度R達到97.9%。圖3上側曲線是經過擬合后的譜線，下側曲線為擬合分離出的譜線，將圖3中各特征峰曲線進行分析處理，計算800～1 500 cm-1內的吸收峰相對峰面積列于表3中[19]。為了消除檢測過程中因處理方式不同帶來的峰面積的不可比性,以1 033，1 085.9，1 131.2 cm-1處吸收峰面積之和為標準峰來計算800～1 500 cm-1

圖3　淀粉樣品的分峰圖譜Fig.3　Raman spectra of starch samples by peakfit

內各吸收峰的相對峰面積。計算公式為：

(1)

式中：Rx，X位置處吸收峰相對峰面積；Px，分峰所得X位置處吸收峰面積；P標，分峰所得1 033，1 085.9，1 131.2 cm-1處吸收峰總面積。

表3　peakfit分峰擬合后所得拉曼吸收峰的相對峰面積Table 3　Relative peak areas of starch samples by peakfit

由圖3和表3可知，處理后得到的不同淀粉，經過分峰擬合后，峰位置基本不變，擬合峰分別出現在856.13、931、1 033、1 085.9、1 131.2、1 213.7、1 261.3、1 336.1、1 388.9、1 455 cm-1等處，1 131.2，1 336.1 cm-1處的峰與淀粉的單螺旋結構相關，淀粉與配體復合時，雙螺旋解旋為左手單螺旋結構[20]，使復合物中單螺旋結構增加，表現為1 131.2、1 336.1 cm-1處相對峰面積增大。在800～1 500 cm-1之間，兩種復合物也可以擬合成10個峰，且相對峰面積大致相同，可以看出復合過程對該處影響不大。

2.4　2 909.45 cm-1處淀粉結構分析

對2 909.45 cm-1處的拉曼光譜進行分峰處理，不同結構淀粉的分峰圖譜見圖4。

平滑度SM設定2.96%，基線誤差限tol設定3.0%，掃描放大值Amp設定1.50%，擬合度R達到97.9%。將圖4中各特征峰曲線進行分析處理，計算各吸收峰相對峰面積列于表4。以2 911，2 965 cm-1處特征峰面積之和為標準峰來計算各吸收峰的相對峰面積，計算公式同式(1)。

由圖4和表4可知，經過分峰擬合后，樣品的峰位置基本不變，擬合峰分別出現在2 911 cm-1和2 965 cm-1等處，其中原淀粉，酸解淀粉和B型淀粉的相對峰面積基本一致，均為0.34左右，復合物的相對峰面積為0.40左右。復合后，在2 965 cm-1處的分峰面積增大。因此，復合過程對2 909.45 cm-1處的峰影響較大。淀粉-十二醇復合物的峰面積大，可能與配體鏈長有關，即鏈越長，該配體復合物在2 965 cm-1處的峰面積越大。

圖4　五種不同結構淀粉的分峰圖譜Fig.4　Raman spectra of starch by peakfit

樣品特征衍射峰面積2911cm-12965cm-1相對峰面積R脫脂原淀粉2.14×1061.125×1060.34酸解淀粉7.17×1053.73×1050.34B型微晶淀粉4.16×1052.23×1050.35淀粉-正癸醇復合物3.34×1052.07×1050.38淀粉-十二醇復合物5.36×1053.83×1050.42

3　結論

X-衍射圖譜表明，馬鈴薯原淀粉、酸解馬鈴薯淀粉和B型淀粉微晶均為B型結構，復合物為V型結構。以馬鈴薯淀粉為原料，對比不同結晶結構淀粉的拉曼光譜，結果表明，從原淀粉到直鏈淀粉與正癸醇復合過程中，拉曼光譜特征峰強度逐步下降。

對比不同醇的復合物，不同復合物的特征峰位置基本一致，強度上相差較大，可能是由于配體差異或條件的不同。使用PeakFit v4.12對拉曼散射峰進行分峰處理。分峰擬合的相對峰面積也發生了變化，淀粉與配體復合時，雙螺旋解旋為左手單螺旋結構，使復合物中單螺旋結構增加，表現為1 131.2 cm-1和1 336.1 cm-1處相對峰面積增大。2 965 cm-1處醇復合物的相對峰面積隨配體鏈長的增大而增大。

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