豬流行性腹瀉病毒檢測方法研究進展

湖北三峽職業技術學院農學院 （湖北宜昌） 443000

劉風光 長陽土家族自治縣動物衛生監督所（湖北宜昌） 443500

李先富 宜昌市月亮石牧業有限公司（湖北宜昌） 443000

豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由冠狀病毒科豬流行性腹瀉病毒 (Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的，可導致豬嘔吐、水樣腹瀉、脫水和仔豬高致死率為特征的高度接觸性消化道傳染病。該病一年四季均有發生，但是多發生于冬春季節。1971年該病首次報道于英國，隨后許多國家相繼報道[1]，我國于1976年發現該病[2]，各日齡的豬均可感染PEDV發病，其中哺乳仔豬受到的危害最嚴重，給生豬養殖造成了巨大的經濟損失[3,4]。分子生物學檢測方法以檢測速度快、靈敏度高和特異性好等特點已經廣泛應用于細菌及病毒病的檢測，并展示出了良好的應用前景。本文就目前國內外PEDV檢測的分子生物學方法的最新研究進展進行綜述，為豬流行性腹瀉的診斷和防控提供參考。

1 巢式PCR檢測方法

劉琪等研究人員[5]根據GenBank中豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的基因序列分別設計2對引物，在完成最佳條件的篩選、特異性和敏感性試驗的基礎上，建立了一種快速區分PEDV疫苗毒株與野毒株的巢式PCR檢測方法。建立的PCR快速檢測方法能夠分別對PEDV疫苗毒株和野毒株擴增出特異性片段，片段大小分別為774bp和150bp。該方法對傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、輪狀病毒(RV)、豬瘟病毒（HCV）和偽狂犬病病毒（PRV）則不能擴增出特異性片段。該方法具有快速、靈敏、特異和通用等特點，可用于實驗室的快速診斷、分子流行病學的調查和野毒株的分離鑒定。

2 多重RT-PCR檢測方法

秦毅斌等[6]根據GenBank中PEDV變異毒株、經典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因，設計合成2對特異性擴增引物，通過目的片段的數量和片段大小來判斷PEDV的毒株類型，建立了檢測不同PEDV毒株類型的雙重RT-PCR鑒別檢測方法，該方法中PEDV變異毒株能同時擴增出234bp和826bp2條目的條帶，PEDV經典毒株只能擴增出1條234bp的目的條帶，弱毒疫苗株只能擴增出1條185bp的目的條帶，該方法檢測A群豬輪狀病毒（PRoVA）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細小病毒 （PPV）、偽狂犬病病毒 （PRV）、豬嵴病毒（PKV）、豬乙型腦炎病毒 （JEV）、豬圓環病毒2型（PCV2）和豬細環病毒（TTV）均為陰性，能檢測到的最低核酸濃度為2.3×10-4ng/μl，該方法檢測91份臨床腹瀉樣品，變異毒株陽性感染率為62.64%（57/91），經典毒株陽性感染率為3.30%（3/91），弱毒疫苗株陽性率為4.40%（4/91）。該多重RT-PCR鑒別檢測方法能夠特異性區分PEDV變異毒株、經典毒株和弱毒疫苗株，可用于PEDV經典株、變異株和疫苗株的臨床快速鑒別檢測和流行病學調查。

施開創等[7]針對PEDV的S基因和ORF3基因序列設計3對特異性引物，經過反應條件的優化，建立了能夠同時檢測并區分PEDV經典株、變異株和疫苗株的三重RT-PCR方法，該方法中能夠同時擴增出429bp和198bp者為經典株，能夠同時擴增出274bp和198bp者為變異株，能夠同時擴增出429bp和148bp者為疫苗株。該方法利用3對特異性引物實現了在同一個擴增反應中鑒別檢測PEDV3種不同毒株的目標，為PEDV變異毒株的鑒別診斷與流行病學調查提供了可靠的技術手段。

顏邦斌等[8]為了建立一種快速鑒別檢測豬流行性腹瀉病毒(PEDV)變異毒株的方法，試驗采用特異性試驗、敏感性試驗和臨床應用等方法對鑒別診斷PEDV變異毒株的一步法雙重RT-PCR方法進行了研究。結果表明∶該方法對PEDV變異毒株能夠擴增出大小為870bp和543bp的2條特異性條帶，對PEDV經典毒株和疫苗株均只能擴增出大小為543bp的1條特異性條帶；對豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(RV)、豬瘟病毒 (CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和豬圓環病毒2型(PCV－2)均無任何擴增條帶；對變異毒株、經典毒株、疫苗株的檢測靈敏度分別達0.75ng、0.80ng、0.09ng的RNA含量。用該方法檢測136份豬腹瀉病料樣品，共檢測出陽性樣品72份，其中變異毒株陽性樣品65份，變異毒株陽性率達47.79%，與基于S基因單重RT-PCR方法和基于ORF3基因單重RT-PCR方法的符合率均為100%。說明雙重RT-PCR鑒別檢測方法具有良好的特異性和敏感性，操作簡單，可以準確、快速鑒別診斷出PEDV變異毒株。

3 RT-LAMP檢測方法

環介導等溫核酸擴增 (Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術依賴6條特異引物和1種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下快速、高效、高特異和高靈敏地擴增靶序列。逆轉錄環介導等溫核酸擴增(RT-LAMP)是在原反應液中加入一定量的逆轉錄酶，可以實現RNA的一步擴增。田野等[9]建立起RT-LAMP技術，對實驗室送檢的40份仔豬腹瀉病料進行檢測，同時使用常規RT-PCR方法和膠體金試劑盒進行檢測并比較試驗結果。RT-LAMP的陽性檢出率30%要比膠體金試劑盒檢測(10%)和PCR(12.5%)高。而且該技術的最大優點就是無需精密的儀器，操作簡單快捷，因此適合中小型豬場對病原的快速診斷。

4 TaqMan熒光定量PCR檢測方法

桑益旸等[10]基于豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的 N 基因，建立了 PEDV的TaqMan探針RT-PCR檢測方法。以標準質粒繪制log10拷貝數與Ct之間標準曲線的線性相關系數值為0.996，檢測靈敏度為100拷貝/μl，對傳染性胃腸炎病毒的檢測結果均為陰性，批內和批間的變異系數均小于1%，表明該方法具有良好的特異性、靈敏性和穩定性。對不同代次細胞培養上清液中的病毒樣品進行檢測，結果表明該方法能夠滿足PEDV野毒株分離過程中的病毒定量檢測需要。

5 病毒抗體ELISA檢測方法

趙玉龍等[11]為檢測豬血清中豬流行性腹瀉病毒(PEDV)抗體水平，以純化的PEDV作為包被抗原，優化ELISA反應條件，建立了檢測PEDV血清IgG抗體的診斷方法。當血清OD（450nm）值＞0.31時，判定陽性；當 OD（450nm）值小于 0.26時，判定陰性；當 OD（450nm）值介于兩者之間判定可疑。結果表明，試驗建立的ELISA抗體檢測方法可用于檢測豬血清中豬流行腹瀉病毒抗體、監測豬流行腹瀉病的流行情況和評價相關疫苗的免疫效果。孫冰等[12]以原核表達的豬流行性腹瀉病毒AH2012株N蛋白為包被抗原，通過條件優化建立了一種快速的間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測方法。利用該ELISA檢測豬流行性腹瀉病毒血清時為陽性，而與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、口蹄疫病毒，豬圓環病毒2型、豬呼吸道冠狀病毒的陽性血清均無交叉反應；批內和批間重復性試驗的變異系數均小于5.55%；該方法與中和試驗檢測結果總符合率為88.75%。本研究建立的方法可以應用于我國豬流行性腹瀉病毒的診斷、流行病監測以及疫苗研發時抗體水平的檢測，為該病的防控提供一種有效的檢測工具。

6 實時熒光RPA等溫檢測方法

呂繼洲等[13]基于PEDV病毒M基因保守序列，設計一系列擴增引物及其熒光探針，以包含PEDV病毒M基因片段的PUC57質粒為模板，同時以包含豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環病毒 2型（PCV2）及古典豬瘟病毒（CSFV）等病毒膜蛋白或核衣殼蛋白基因序列的質粒作為對照，建立了一種PEDV實時熒光重組酶聚合酶擴增（RPA）等溫檢測方法，測定了方法的特異性與敏感性。結果表明，該實時熒光RPA方法可在39℃恒溫反應20分鐘。特異性擴增PEDV病毒M基因，與TGEV、PRRSV等對照病毒基因無交叉反應，其檢測限為10拷貝/μl。應用該實時熒光RPA方法可有效檢測出血漿及血漿蛋白粉中的PEDV核酸。本研究建立的實時熒光RPA檢測方法簡單、快速、靈敏度高，可為PEDV的檢測防控提供一種新的、可靠的技術支持。

7 實時熒光定量RT-PCR檢測方法

楊峰等[14]為建立了一種特異、靈敏、量化、快速的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）檢測方法，設計1對PEDV N基因的特異性引物，建立Eva Green染料的實時熒光定量RT-PCR的檢測方法，并對疑似PEDV感染的臨床樣品進行檢測。結果顯示，所建立的實時熒光定量RT-PCR方法的標準曲線具有良好的線性關系，線性相關系數R2=0.999；不與豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）發生交叉反應，具有較強的特異性；靈敏度比常規RT-PCR方法高100倍；重復性試驗的變異系數均小于5%，重復性良好。對43份臨床樣品進行檢測，結果比普通PCR多檢出2份陽性。結果表明，本研究建立的實時熒光定量RT-PCR檢測方法在特異性、靈敏度和重復性方面都很好，可用于臨床PEDV檢測。

8 雙抗體夾心ELISA檢測方法

王晨燕等[15]采用特異性好的鼠源抗豬流行性腹瀉病毒（PEDV）單克隆抗體為捕獲抗體，兔源多克隆抗體為檢測抗體，建立PEDV雙抗體夾心ELISA檢測方法。結果顯示，該方法的最佳反應條件為：抗PEDV單克隆抗體 E1包被質量濃度 4.40μg·ml-1，37℃包被 2小時，采用5%BSA封閉液封閉1小時，兔抗PEDV抗體工作質量濃度為5.91μg·ml-1，酶標二抗稀釋度為1∶2000，以OD(450nm)≥0.381作為陽性判定標準。該ELISA方法對豬輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒無交叉反應。敏感度可達30μg·ml-1；重復性變異系數小于10%。采用該方法和RT-PCR方法同時檢測臨床樣品42份，陽性樣品符合率為92.30%，表明建立的PEDV雙抗體夾心ELISA檢測方法具有特異性好、敏感性高和方便快捷等優點，可用于PEDV快速檢測。

9 套式PCR檢測方法

套式PCR方法是設計內、外2對引物，通過2次擴增對樣品檢測，該方法能夠節省時間和試劑用量，而且敏感性較高。王金良等[16]根據已發表的PEDV N基因核苷酸序列，設計合成2對引物，建立了檢測PEDV的套式RT-PCR方法，其中外引物擴增片段長度為297bp，內引物擴增片段長度為212bp。