Neuropilin-1在結腸癌中的表達及其與預后的關系

王輝 謝榮俊 劉龍飛 李峰

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，隨著生活方式及飲食結構的改變，其發病率逐年升高，雖然結腸癌5年生存率較高，但其高復發性及遠處臟器轉移是最主要死因。神經纖毛蛋白-1（Neuropilin n-1,NRP-1）為血管內皮生長因子(VEGF)的一種新型細胞受體，參與多種惡性腫瘤的發生及轉移[1]。本研究分析Neuropilinns-1在結腸癌中的表達情況及其與預后的關系，旨在為結腸癌診治提供理論依據。

1　材料與方法

1.1一般資料 收集2011年9月～2012年3月我院胃腸外科手術結腸癌患者石蠟切片58例，所有患者具有完整臨床資料及隨訪資料。男36例，女22例，年齡31～86歲。按照第七版AJCC/UICC的標準TNM分期，Ⅰ/Ⅱ期15例，Ⅲ期43例。對入選患者采用書信和電話進行隨訪，隨訪時間3～32月，以患者出院為隨訪起點，死亡或最后隨訪時間為終點，終止隨訪時間為2014年10月30日。

1.2實驗方法 免疫組織化學檢測NRP-1蛋白的表達，石蠟切片脫蠟，3%H2O2阻斷過氧化物酶，抗原修復，血清封閉，上NRP-1一抗，4℃過夜，上二抗溫育，加抗生物素蛋白工作液，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、固定。以PBS作為對照物，細胞漿、細胞膜或者細胞核呈現淺黃色、黃色、棕褐色分別為弱陽性、陽性、強陽性。圖像分析：20倍顯微鏡下計算隨機100個陽性細胞灰度值的平均值（背景灰度值-實測灰度值），灰度值越小，顏色越深。兔抗人NRP-1單克隆抗體購于美國Novus公司，二抗及免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.3統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件對數據進行分析，以±s表示計量資料，采用t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析；計數資料用百分比表示，采用χ2檢驗，生存分析使用Kaplan-Meier法。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2　結果

2.1免疫組化檢測結腸癌中NRP-1蛋白的表達情況 NRP-1主要表達于細胞胞漿內，結腸癌細胞異性明顯，核分裂明顯，見圖1、2。結腸癌組織中NRP-1蛋白表達明顯高于癌旁組織，見表1。

圖1　癌旁組織中NRP-1蛋白的表達（S P×200）

圖2　結腸癌中NRP-1蛋白的表達（S P×200）

表1　結腸癌及癌旁組織中 NRP-1蛋白的表達（±s）

表1　結腸癌及癌旁組織中 NRP-1蛋白的表達（±s）

組織 NRP-1 表達 NRP-1陽性[n(%)]結腸癌組織 138.17±9.05 39（67.24）癌旁組織 92.42±7.81 7（12.07）t/χ22.46418.445 P 0.017 0.016

2.2生存分析 Kaplan-Meier生存分析結果顯示，NRP-1陽性表達患者的32月生存率明顯低于陰性表達患者（χ2=6.832，P=0.009），見圖 3。

圖3　NRP-1陽性及陰性表達結腸癌患者生存率曲線圖

3　討論

NRP-1最初研究多數集中在神經系統和心血管疾病中，近年來，NRP-1被發現在多數惡性腫瘤中高度表達而逐漸被重視。Ding[2]在小細胞肺癌中發現NRP-1與腫瘤密切相關，并且NRP-1可能介導腫瘤的浸潤及轉移，具體途徑可能為參與腫瘤血管生成。國內學者李明[1]在胃癌中也發現，NRP-1主要表達在腫瘤細胞膜和細胞質內，與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織NRP-1表達明顯升高，同時發現其表達與腫瘤浸潤深度和淋巴結轉移有關，并且發現與VEGF也密切相關，由此推斷NRP-1可能扮演VEGF受體角色，參與腫瘤血管的生成，從而介導胃癌的發生與發展。本研究結果顯示，結腸癌組織中NRP-1蛋白高度表達，而在癌旁組織為低度表達，說明NRP-1與結腸癌相關，參與結腸癌的發生與發展。生存分析中發現，NRP-1陽性表達結腸癌患者32月生存率明顯低于陰性表達患者，更進一步說明NRP-1的高表達參與結腸癌的發生及發展，并導致患者預后不良。

NRP-1可分為膜性NRP-1和可溶性NRP-1，是具有跨膜功能的糖蛋白，位于細胞表面的神經纖維軸突上，能夠調節神經細胞導向、軸突生長作用，正常機體中的NRP-1主要在內皮細胞、成骨細胞和骨髓基質細胞等組織表達[3]。可作為受體與多種配體如Sema3、胎盤生長因子2、TGF-β1、bFGF、VEGF和PDGF等結合[4]。研究顯示，NRP-1可與VEGF家族中較多的血管生成因子的酪氨酸激酶受體相互作用，從而增強信號轉導，促進血管生成，誘發腫瘤的生成，并促進腫瘤的生長。在上皮-間質轉化中NRP-1還可以作為啟動子，對腫瘤侵襲和進展均發揮重要作用[5]。研究發現，超過98%的NRP-1高表達均來自腫瘤血管，并且其表達水平主要取決于腫瘤組織來源、組織大小和分期程度，還與腫瘤侵襲、轉移以及預后不良相關。在各種基質中也有NRP-1的表達，如內皮細胞、成纖維細胞和免疫細胞，并被不同的VEGF-A生長因子所激活，從而導致腫瘤進展[6]。因此，NRP-1通過多種途徑和因素參與腫瘤的發生，這是因為腫瘤的形成本身就是多種機制參與的“交叉對話”[7]。

綜上所述，NRP-1的高度表達與結腸癌密切相關，參與結腸癌的發生及發展，并導致患者預后不佳。因此NRP-1可作為評價結腸癌生物學行為指標之一，并對監測患者生存期具有一定的指導作用，同時，NRP-1也可能對結腸癌靶向治療具有一定的臨床價值。但是，本研究仍有不足之處，如非前瞻性研究，必然可能造成選擇性偏倚；實驗中缺少結腸正常組織對比，不清楚NRP-1在正常結腸組織中的表達情況；研究只說明NRP-1蛋白在結腸癌的表達和結腸癌患者預后情況，未系統闡明其參與的相關機制，以上這些不足之處將在后續研究中得以補充，以完善本課題研究方案。

1 李明，李強. Neuropilin-1 及VEGF 在胃癌組織中的表達與微血管生成的關系[J]. 中國腫瘤臨床，2014，5（41）：332-336

2 Ding M，Liu L，Hu C，et al.Expression of VEGFR2 and NRP-1 in non-small cell lung cancer and their clinical significance[J].Chine J Cancer Res，2014，26（6）：669-677

3 Jubb AM，Strickland LA，Liu SD，et al.Neuropilin-1 expression in cancer and development[J].J Pathol，2012，226（1）：50-60

4 Choi J，Yang ES，Cha K，et al.The Nuclear Matrix Protein，NRP/B，Acts as a Transcriptional Repressor of E2F-mediated Transcriptional Activity[J].Journal of Cancer Prevention，2014，19（3）：187-198

5 Zachary I. Neuropilins： role in signalling，angiogenesis and disease[J].Chem Immunol Allergy，2014，99：37-70

6 Sun J，Wang L，Lou W，et al.NRP-1/shRNA silencing suppresses nasopharyngeal carcinoma cell growth in vitro and in vivo[J].Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2015，50（4）：312-317

7 王輝，牛國梁，張樹友，等. 姜黃素對人乳腺癌MDA-MB-231 細胞裸鼠移植瘤放射增敏的作用[J]. 中國癌癥雜志，2012，5（22）：342-346