異育銀鯽中鯉皰疹病毒Ⅱ型載量測(cè)定方法的建立

李雙 ，吳霆 ，2，顧偉 ，孟慶國(guó) ，王文

（1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省水生甲殼動(dòng)物病害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.寶應(yīng)縣水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 寶應(yīng) 225800）

1 引言

鯽魚(yú)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一[1]，其分布廣，肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，一直受到我國(guó)消費(fèi)者的青睞，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，近幾年來(lái)，鯽魚(yú)呈現(xiàn)出越來(lái)越大的養(yǎng)殖潛力。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年我國(guó)養(yǎng)殖鯽產(chǎn)量已達(dá)340多萬(wàn)噸，在我國(guó)淡水養(yǎng)殖中占有十分重要的地位[2]，而異育銀鯽是中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所培育出來(lái)的鯽魚(yú)的一個(gè)品種[3-4]，具有個(gè)頭大、出肉率及成活率高[5-6]、肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，越來(lái)越受到廣大養(yǎng)殖戶(hù)的喜愛(ài)，其產(chǎn)量持續(xù)增長(zhǎng)，并帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

然而，大規(guī)模病害的爆發(fā)阻礙了異育銀鯽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，如寄生蟲(chóng)病、細(xì)菌性疾病、真菌性疾病、病毒性疾病等。2012年來(lái)，異育銀鯽養(yǎng)殖區(qū)出現(xiàn)了越來(lái)越嚴(yán)重的鰓出血性疾病，造成了大規(guī)模的死亡，帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，經(jīng)鑒定引起這種疾病的是鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2），引起了廣泛研究者的研究興趣。CyHV-2最早于1992年在日本的金魚(yú)中被發(fā)現(xiàn)[7，10]，稱(chēng)為“金魚(yú)皰疹病毒性造血器官壞死癥”，將該病毒稱(chēng)“金魚(yú)造血器官壞死病毒”(Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV)[7，10]。2012年中國(guó)江蘇出現(xiàn)的CyHV-2是第二個(gè)從鯉科魚(yú)中分離出的病毒，國(guó)際病毒系統(tǒng)分類(lèi)與命名委員會(huì)命名其為鯉皰疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpes virusⅡ，Cy－HV-2)[8-9]，因其可造成鯽魚(yú)造血組織器官壞死，所以又稱(chēng)該病毒為“皰疹病毒性造血器官壞死癥病毒”，(Herpes viral haematopoietic necrosis virus，HVHNV)[9,25－26]。鯉科魚(yú)皰疹病毒目前分為三個(gè)型，分別為鯉痘瘡病毒 （Carp pox herpes virus，Cyprinid herpes virus，CyHV-1）；鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）及錦鯉皰疹病毒（Koi herpes virus，Cyprinid herpes virus 3，CyHV-3）。CyHV-2與CyHV-3關(guān)系較近，而與CyHV-1關(guān)系較遠(yuǎn)[9-10]；CyHV-2核衣殼呈六邊形，直徑為100～110 nm；CyHV-2病毒具有囊膜，呈橢圓形，直徑為 175～200 nm[11-12]。CyHV-2具有高致病性，病死率可達(dá)90%～100%，主要感染金魚(yú)，鯽魚(yú)及其變種，不感染鯉魚(yú)和錦鯉。該病發(fā)病水溫范圍為15～32 ℃，流行高峰為20～28℃[13-14]。魚(yú)發(fā)病時(shí)表現(xiàn)的病癥為活動(dòng)緩慢，不活潑，鰓部和鰭基部有出血點(diǎn)，魚(yú)鰾有出血斑點(diǎn)，尾鰭末端發(fā)白等。

目前對(duì)該病毒的檢測(cè)方法主要有普通PCR[15]、巢式 PCR[16]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增[17-18]、電鏡觀(guān)察[19]、細(xì)胞培養(yǎng)分離法[20]等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、快速準(zhǔn)確方便等優(yōu)點(diǎn)，既能定性檢測(cè)也能夠定量檢測(cè)，在水生病原微生物的檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。定量檢測(cè)異育銀鯽體內(nèi)的CyHV-2有基于TaqMAN探針?lè)椒ǖ臒晒舛縋CR方法的建立，但是沒(méi)有基于SYBR Green法建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法，且利用熒光定量PCR來(lái)研究CyHV-2在魚(yú)體內(nèi)組織器官分布的報(bào)道還是一片空白?；赟YBR Green法簡(jiǎn)單快捷等特點(diǎn)，本文建立了SYBR Green法實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量方法，并研究了魚(yú)體內(nèi)各個(gè)器官的病毒載量，體現(xiàn)了不同器官CyHV-2的分布情況，為該病毒的免疫學(xué)研究提供了數(shù)據(jù)和奠定了研究基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)和病毒來(lái)源

2.1.1 實(shí)驗(yàn)健康魚(yú) 試驗(yàn)用健康100尾異育銀鯽來(lái)自于江蘇省寶應(yīng)縣沒(méi)有發(fā)病史的養(yǎng)殖塘口，Cy－HV-2 PCR檢測(cè)陰性，體質(zhì)量為280～400 g，養(yǎng)殖在紫外殺菌水控溫增氧循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（上海海圣）中，溫度控制在26～28℃，在處理前先暫時(shí)養(yǎng)殖1周。

2.1.2 病毒來(lái)源 CyHV-2病毒由江蘇省寶應(yīng)縣具有明顯出血病發(fā)病癥狀、且CyHV-2 PCR檢測(cè)陽(yáng)性的異育銀鯽體內(nèi)分離得到，病魚(yú)來(lái)自江蘇寶應(yīng)縣養(yǎng)殖戶(hù)發(fā)病塘口，發(fā)病當(dāng)天將這些垂死新鮮病魚(yú)收集起來(lái)用于病毒液的提取。

2.2 生物實(shí)驗(yàn)試劑

PBS配方：磷酸緩沖液PBS(pH 7.5)100 mL A液：2.53%NaH2PO4·2H2O 83 mL；B 液：2.52%NaOH 17 mL。

5%chelex-100配方：稱(chēng)取5 g chelex-100固體顆粒放入100 mL ddH2O中，混勻，放于4℃冰箱保存。

Chelex-100、protease K、2 000 DNA Marker、2×EasyTay PCR Super Mix、滅菌雙蒸水等均購(gòu)自南京百斯凱生物公司。SYBR premix Ex TaqⅡ購(gòu)自Takara公司。RNAfree水購(gòu)自北京全式金生物公司。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 病毒的分離與純化 用75%酒精消毒病魚(yú)，解剖后取病魚(yú)的腎臟、鰓，放在勻漿器里，然后加5 mL PBS在冰上研磨3～5 min；將研磨液倒入50 mL離心管中放入離心機(jī)中4 000 r/min室溫離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)移至另一支新的50 mL離心管中；在超凈工作臺(tái)中純化病毒粗提液，先用1 mL PBS潤(rùn)濕0.22 μm濾器，然后病毒粗提液經(jīng)0.22 μm濾器后過(guò)濾至新的50 mL離心管中；將過(guò)濾的病毒液分裝在1.5 mL的離心管中放4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 病毒回感和病魚(yú)組織的獲取 取兩支病毒液1 mL，每尾健康魚(yú)進(jìn)行胸鰭注射100 μL，共回感20尾，之后每天觀(guān)察魚(yú)的發(fā)病特征和有無(wú)死亡。取有典型發(fā)病癥狀魚(yú)的腎、鰓、脾、肝、腸、肌肉和卵，用于DNA的提取。

2.3.3 DNA的提取 將獲取的組織（0.1～0.5 g）放入1.5 mL離心管中，然后用牙簽攪碎成勻漿狀；加入200 μL 5%chelex和20 μL蛋白酶K至組織勻漿液，旋渦儀振蕩混勻，56℃水浴鍋中水浴20 min，用漩渦器振蕩混勻后再99℃水浴鍋水浴8 min；之后4 ℃，12 000 r/min，離心 4 min，之后取上清，用移液槍輕輕轉(zhuǎn)移到另一新離心管中即為DNA粗提液，標(biāo)記好后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.4 普通PCR檢測(cè)

2.3.4.1 引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)和合成引物：

CyHVpol-F:5'-CCCAGCAACATGTGC-GACGG-3'；

CyHVpol-R:5'-CCGTARTGA-GAGTTGGCGCA-3'。

擴(kuò)增CyHV-2特異性聚合酶基因362 bp片段。

2.3.4.2 PCR擴(kuò)增體系 上下游引物1μL，2×Easy－Tay PCR Super Mix 12.5 μL，滅菌雙蒸水 10 μl，DNA 模板 0.5 μL，總共 25μL，混勻。

2.3.4.3 PCR擴(kuò)增程序 PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 3 min；94℃變性 3 s、56 ℃退火 15 s、72℃延伸10 s，35次循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保溫。

2.3.4.4 瓊脂糖凝膠電泳 取5 μL PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳跑膠，120 V，25 min，并在紫外燈下查看擴(kuò)增效果，檢測(cè)有無(wú)目的基因片段的擴(kuò)增。

2.3.5 熒光定量PCR

2.3.5.1 引物設(shè)計(jì) 利用Primer 5設(shè)計(jì)引物如下：

CyHV-16-QF:5'-TTACTGGAGGTCGGTGAAGG-3'；

CyHV-16-QR:5'-CGTCTGGAAAGCGTGTGACT-3'。

2.3.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系 熒光定量PCR體系共 10 μL，上下游引物各 0.4 μL，SYBR Green核酸染料加 5μL，RNA free H2O 3.2 μL，DNA 模板1 μL。

2.3.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序 預(yù)變性：95℃，5 min；擴(kuò)增 40個(gè)循環(huán)：95 ℃，10 s，60 ℃，30 s；溶解曲線(xiàn)：95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，95 ℃，15 s。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 普通PCR檢測(cè)結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)前，為了保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，在給健康魚(yú)注射病毒前，對(duì)用于提取病毒液的4條垂死病魚(yú)的腎組織進(jìn)行了普通PCR檢測(cè)，看這些病魚(yú)是否真正的感染上病毒，得到的結(jié)果如下圖1，可以看到這4條魚(yú)的檢測(cè)結(jié)果中，4條病魚(yú)的腎組織皆為陽(yáng)性?？傊?，這些病魚(yú)提取的病毒液可以放心用于人工回感。另外，回感過(guò)后也對(duì)提取的病毒液進(jìn)行了PCR檢測(cè)，結(jié)果也呈陽(yáng)性。

圖1用于提取病毒液的病魚(yú)組織PCR結(jié)果

3.2 疾病感染癥狀

圖2異育銀鯽人工感染鯉皰疹病毒Ⅱ型后的疾病癥狀和健康魚(yú)的對(duì)比（A：感染3d后有明顯病癥的病魚(yú)；B：健康魚(yú)作為對(duì)照）

與正常魚(yú)相比，回感的魚(yú)出現(xiàn)行動(dòng)緩慢等反應(yīng)。從第2天開(kāi)始魚(yú)出現(xiàn)了輕微病癥，第3天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，都有明顯的病癥：鰭基部有出血點(diǎn)、尾鰭末端發(fā)白、眼球突出、行動(dòng)緩慢等，第7天90%回感魚(yú)死亡。

3.3 溶解曲線(xiàn)

在real-time PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)后，進(jìn)行了溶解曲線(xiàn)分析，表明該引物的的特異性較強(qiáng)。由得到的溶解曲線(xiàn)可以看出CyHV-2的溶解溫度為84.5℃（如圖3）。而陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)。

圖3 CyHV-2 real-time PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)后產(chǎn)物的溶解曲線(xiàn)

3.4 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

將獲取的DNA模板測(cè)定濃度后，10倍梯度稀釋?zhuān)謩e以 6.07×108～6.07×102copies/L 為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1、圖4，計(jì)算并得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y=-3.6399x+36.941，R2=0.9998。3.5 QRT-PCR檢測(cè)CyHV-16的組織分布

表1熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制相關(guān)數(shù)值

圖4熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).橫坐標(biāo)為CyHV-16基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值；縱坐標(biāo)為起始擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)

QRT-PCR檢測(cè)CyHV-16在發(fā)病異育銀鯽各個(gè)組織的表達(dá)分布，圖5結(jié)果顯示CyHV-16幾乎分布在被感染的異育銀鯽的各個(gè)組織和器官，如脾臟、腎臟、鰓、肝臟、腸道和肌肉組織等，但是卵巢中未檢測(cè)到。其中CyHV-16在脾臟組織中表達(dá)量最高，在腎、肝臟和鰓中次之，肌肉組織中表達(dá)量較少。

圖5 QRT-PCR檢測(cè)CyHV-16在不同組織中的表達(dá)分布差異分析

4 討論

鯽魚(yú)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種，而異育銀鯽因其生長(zhǎng)快速，食性雜，易飼養(yǎng)，含肉率高，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而廣受消費(fèi)者的青睞，對(duì)我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展起著重要的作用，而疾病對(duì)其造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失，因此，對(duì)異育銀鯽病害的防治對(duì)淡水養(yǎng)殖業(yè)的越來(lái)越好的發(fā)展至關(guān)重要。CyHV-2是目前危害異育銀鯽養(yǎng)殖業(yè)最大的病原，可造成100%的病死率，因此，建立一種CyHV-2定量檢測(cè)技術(shù)對(duì)于有效預(yù)防控制該病毒具有重要的意義。

目前對(duì)病毒的檢測(cè)方法中，應(yīng)用最為廣泛的是PCR檢測(cè)。Goodwin等基于CyHV-2聚合酶基因建立的PCR方法將取自美國(guó)患鯉皰疹病毒Ⅱ型病的金魚(yú)組織中提取的DNA擴(kuò)增出目的基因片段，且目的基因序列與Waltzek等[11]報(bào)道的CyHV-2基因序列也有99%以上的一致性。薛忠儀等[8]建立了一種快速檢測(cè)CyHV-2的PCR檢測(cè)方法，該方法運(yùn)用Chelex-100這一離子螯合劑快速粗提組織DNA[8]，該方法提取快速簡(jiǎn)單，大大縮短了提取時(shí)間，僅僅需要1 h內(nèi)就可完成實(shí)驗(yàn)，大大提高了CyHV-2檢測(cè)的效率。但是該方法只能粗略的檢測(cè)組織中有無(wú)CyHV-2，卻無(wú)法定量病毒數(shù)的多少。于力等[12]人建立的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR方法，他們依據(jù)CyHV-2的主要衣殼蛋白MCP基因，不僅設(shè)計(jì)了普通PCR引物，還設(shè)計(jì)了Taqman熒光探針引物，比較繁瑣，而且他們對(duì)所有病魚(yú)組織混在一塊提取DNA，只是對(duì)該病毒與其他病原菌做對(duì)比，進(jìn)行特異性和靈敏性驗(yàn)證，并不能看出病魚(yú)各個(gè)組織中該病毒的分布情況；周勇等[21]雖然建立了Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR定量CyHV－2的方法，是試驗(yàn)中合成探針引物，過(guò)程較復(fù)雜，并且沒(méi)有進(jìn)一步研究CyHV-2在各組織的分布情況。而本文建立的Realtime PCR方法（SYBR Green法）在快速提取DNA的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，簡(jiǎn)單快速，不需要設(shè)計(jì)合成探針引物等優(yōu)點(diǎn)，不僅能夠定性檢測(cè)，而且可以定量病毒載量的多少，是一種即快速準(zhǔn)確又能定量各個(gè)組織內(nèi)病毒拷貝數(shù)的有效的檢測(cè)方法，在此基礎(chǔ)上本文還調(diào)查了各組織中該病毒的不同分布。

綜上可知，本研究基于Chelex-100快速提取核酸的基礎(chǔ)上，建立了快速靈敏高效的Realtime PCR方法（SYBR Green法），可以定量異育銀鯽體內(nèi)Cy－HV-2拷貝數(shù)，這對(duì)以后研究該病毒的致病機(jī)理提供了一定的數(shù)據(jù)參考，為以后有效地預(yù)防和控制該病奠定了基礎(chǔ)。

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