鹽度對瘤背石磺血淋巴生理生化指標及免疫應激指標的影響

沈永龍 ，陳威 ，黃金田 ，李強 ，張明明

由于瘤背石磺生活于潮間帶地區，潮汐、降雨以及人類活動等均可導致潮間帶鹽度發生變化，從而給水生生物產生鹽度脅迫，大量實驗研究表明，鹽度變化對水生動物生長存活、新陳代謝和滲透壓調節等具有顯著影響[1]，同時環境脅迫對水生生物生理機能影響首先通過水生動物體內血液生化指標和免疫指標反映出來。有關環境鹽度影響水生動物血液生化指標和免疫指標變化報道很多，一般認為鹽度突變能夠導致甲殼動物、魚類機體的免疫力下降。潘魯青等[2]對對蝦、李才文等[3]對日本對蝦的研究表明，鹽度突變使得生物體的血細胞數量降低，溶菌酶活性下降。貝類方面，馬洪明等[4]認為鹽度突降會使櫛孔扇貝酸性磷酸酶活性升高。王帥等[5]報道了低鹽脅迫使得中國血蛤非特異性免疫酶活性降低，且長期會抑制某些非特異性免疫因子。因此，可以通過檢測不同鹽度組瘤背石磺血液成分的變化來評價瘤背石磺的健康狀況、營養狀況以及對環境鹽度的適應狀況[6]。鑒于此，本文通過研究鹽度變化對瘤背石磺血液生化指標和免疫指標的影響，從而了解瘤背石磺對環境鹽度變化的適應機制，為進一步提高瘤背石磺的基礎理論研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗用瘤背石磺為采自鹽城射陽河口區灘涂的同一批體質健康個體，經過150 mg/L KMnO4水溶液消毒5 min后采用鋪設底泥、搭置瓦片等模擬自然環境的方式進行溫箱養殖，暫養馴化2 d備用。

1.2 試驗飼料

以螺旋藻作為瘤背石磺的飼料，使用前粉碎均過100目篩，充分混合后作為飼料，晾干保存于冰箱中備用。飼喂時以海泥作為填充物質，海泥與螺旋藻粉按照5：1比例拌飼投喂。

1.3 試驗設計與飼養管理

馴化結束后，選擇個體均一的健康瘤背石磺1 200 只，濕重為（2.96±1.02）g，隨機分成 5 組，分別用不同鹽度梯度（5、15、25、35 和 45）的人工海水飼養于特制的防逃養殖箱（70 cm×50 cm×40 cm）中，每組設置6個重復，每個重復40只。飼養期間所用海泥均為過200目篩絹網的海邊高潮帶表層泥土，將細海泥分別在不同鹽度梯度的海水中完全浸濕5 min后鋪設于養殖箱底部，厚約3 cm，然后將鋪有底泥的養殖箱傾斜30°放置，形成斜坡。在每個箱中噴灑2 L相應鹽度梯度的海水，使其在坡底具有一定的積水，每日添加曝氣后的自來水維持積水量和箱內濕度，同時調節水體鹽度，從而維持瘤背石磺生存環境中鹽度的穩定。

表1試驗飼料配方和營養水平 （%，干物質基礎）

試驗期間箱內氣溫控制為24～26℃、保持箱內濕度88%～90%，每天兩次07：00和17：00用海泥與螺旋藻粉（m：M/20：1）拌飼投喂于固定位置的玻璃食臺，投飼率為2%。每次投喂前清潔養殖箱、食臺及瓦片，投喂后1 h清除殘餌并向養殖箱中分別噴灑不同鹽度梯度的海水，維持瘤背石磺體表濕潤和養殖箱內的濕度。觀察記錄攝食情況并檢查防逃設施是否完好。飼養60 d后，從各處理組中隨機抽取瘤背石磺30只，采集組織樣本測定相關指標，取樣前禁食24 h。

1.4 樣品制備及分析測定

1.4.1 血淋巴生化指標 飼養60 d后，禁食24 h。將從每個箱中隨機取得的瘤背石磺30只用肝素鈉溶液潤洗后的2 mL一次性注射器抽取血淋巴。采用心臟動脈抽血，取全血置于離心管中（含有少量已烘干的肝素鈉），測定總蛋白（TP，雙縮脲法）和白蛋白（ALB，溴甲酚綠法）含量。然后將全血3 500 r/min離心15 min制得血清，測定血清中甘油三酯（TG，甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶法）、膽固醇（CHOL，膽固醇氧化酶-過氧化物酶法）、谷丙轉氨酶（GPT，賴氏法）、堿性磷酸酶（ALP，AMP法）及血糖（GLU，葡萄糖氧化酶法）含量。除血糖外，血淋巴生化指標均采用美國倍肯公司生產的ABBOTTALOYON 300全自動生化分析儀進行分析測定。1.4.2 免疫應激指標 首先取樣制備瘤背石磺血清(同1.4.1)，然后分別用超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(測總)、過氧化氫酶(CAT)測試盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測試盒以及丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)分別測定不同鹽度組相應招標含量。每次測量設置空白對照管、標準對照管、測定管，分別設置三個平行。蛋白定量采用Bradford考馬斯亮藍法。

SOD活力單位定義為：每1mL血淋巴在1mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為1個活力單位（U/mL）。CAT活力單位定義為：每1mL血淋巴每1s分解1μmol H2O2的量為一個活力單位（U/mL）。GSH的比含量定義為：每L血淋巴中GSH的含量（gGSH/L）。MDA的比含量定義為：每1mL血淋巴中MDA的含量（nmol/mL）。

1.5 數據統計與分析

原始數據經Excel 2007初步整理后，采用SPSS 16.0中的單因素方差分析（one-way ANOVA）對數據進行統計分析，并進行Duncan氏多重比較。統計結果表示為平均值±標準誤（Mean±SE），P＜0.05認為差異具統計學意義。同時，Excel作圖，得到各指標值隨鹽度水平變化的柱狀圖，并將血淋巴各個指標數值與增重率進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 鹽度對瘤背石磺血淋巴生化指標的影響

由圖1可以看出，鹽度對瘤背石磺血液生化指標的影響差異顯著。首先，從血清蛋白質和血液中酶類指標看，隨著鹽度的升高，瘤背石磺血清中的總蛋白、白蛋白和球蛋白含量變化趨勢一致，即低鹽度時隨著鹽度升高呈現下降趨勢，且各組之間差異明顯（P＜0.05），而在鹽度35時又突然升高，后又下降。同時，血清中的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和堿性磷酸酶活性隨鹽度的升高變化趨勢稍有差異，但均隨著鹽度的升高呈現下降趨勢。谷丙轉氨酶在鹽度小于25時，各組之間差異不具統計學意義，但當鹽度繼續升高后，谷丙轉氨酶活性顯著下降，而谷草轉氨酶和堿性磷酸酶均在鹽度大于15時，其活性就顯著降低。其次，從糖類和脂類的代謝產物分析，鹽度對血糖和血脂的影響變化趨勢不同。血液中血糖含量隨著鹽度的升高呈現下降趨勢，且鹽度15、25和35組之間無顯著具統計學意義（P＞0.05），但顯著低于鹽度5組，顯著高于鹽度45組（P＜0.05）。而血脂隨著鹽度的升高有一定的降低，但差異不具統計學意義（P＞0.05），而膽固醇在血清中的含量呈現“波浪式”變化，且鹽度5、25和45組之間差異不具統計學意義（P＞0.05）。

圖1瘤背石磺飼養環境鹽度水平與血液各生化指標之間的關系

續圖1瘤背石磺飼養環境鹽度水平與血液各生化指標之間的關系

2.2 鹽度對瘤背石磺免疫應激指標的影響

本試驗研究表明，鹽度對瘤背石磺某些免疫應激有顯著影響。從圖2可以看出，過氧化氫酶在鹽度15時最高，且低鹽度時活性顯著高于高鹽度（P＜0.05）。SOD與CAT相似，均在高鹽度時活性高，但不同的是，SOD在鹽度15時最高，在鹽度5組最低，且顯著高于和低于其他各組（P＜0.05）。MDA含量與GSH相似，在低鹽度時含量顯著低于高鹽度（P＜0.05）。GSH在隨著鹽度的升高，先降低再升高，但隨著鹽度的升高，其含量升高幅度較大。MDA含量在鹽度25時最高，其次是鹽度45組，其余三組之間無顯著影響（P＞0.05）。

圖2瘤背石磺飼養環境鹽度水平與血液各免疫應激指標之間的關系

3 討論

3.1 鹽度對瘤背石磺血淋巴生化指標的影響

血液生化指標能夠反映水生生物健康狀況和生理狀況，可作為判斷生物體是否患病、患病類型和病情輕重的一種簡便依據，它受內外環境以及營養狀況等多種因素的影響[7-8]。鹽度是與水生生物存活和生長密切相關的環境因子之一，其對機體的影響間接表現為物質交換和體內能量的流動。在鹽度脅迫環境中，瘤背石磺必然需要消耗大量的能量——血糖來維持內外環境的水鹽平衡。從本試驗可以看出，在鹽度5時，瘤背石磺血淋巴中血糖濃度最高，顯著高于其他各組，這與洪磊等[9]對許氏平鮋的研究結論相似，即血糖水平與鹽度脅迫強度呈一定的正相關性。但不同的是，在高鹽度時，瘤背石磺血淋巴的血糖濃度較低，這可能是因為滲透壓調節途徑不同低鹽度刺激誘導與糖異生作用相關酶活升高增加血糖濃度，而高鹽度誘導產生不同的滲透壓調節途徑，同時也可能是瘤背石磺對于高滲溶液的滲透壓調節比低滲溶液更有效的原因。

血脂是血漿中甘油三酯、膽固醇和類脂的總稱，是生命細胞基礎代謝的必需物質。在正常情況下，機體中甘油三酯含量和膽固醇含量具有相關性[10]。本試驗發現，隨著鹽度的升高，瘤背石磺血淋巴中甘油三脂含量呈下降趨勢，但無顯著變化，這與黃曉榮研究鹽度對施氏鱘的影響結果一致，但甘油三脂隨鹽度的升高變化具有一定差異性，并不是隨著鹽度的升高呈現單一的先上升后下降趨勢，而是呈“波浪式”變化，具體原因還需進一步研究。

磷酸酶是生物體內的重要代謝調控酶，也是溶酶體酶的重要組成部分，在貝類非特異性免疫中起到重要作用。王帥等[5]對血蛤的研究表明，鹽度脅迫對磷酸酶活性具有抑制作用，且堿性磷酸酶對鹽度的反應比酸性磷酸酶小，且具有滯后性。本試驗結果顯示，低鹽時，瘤背石磺血淋巴中堿性磷酸酶、谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性均較高，這可能是因為低鹽脅迫導致瘤背石磺某些器官，如肝臟，發生損傷，致使大量酶類釋放至血淋巴中。另外，從上面的白蛋白、球蛋白以及白球比可以看出，低鹽度和高鹽度時，球蛋白含量顯著提高，白球比顯著降低說明鹽度脅迫已經造成瘤背石磺免疫抑制作用。

3.2 鹽度對瘤背石磺免疫應激指標的影響

鹽度的變化不僅與水生生物的滲透壓調節 (能量的平衡)、氧吸收和清除率相關[11-14]，還對其免疫力有顯著影響，如改變鹽度能顯著降低日本囊對蝦、凡納濱對蝦等的血細胞的數量和非特異性免疫因子的含量，從而降低其免疫力[15-17]。貝類的體液免疫沒有特異性免疫，只有非特異性免疫，其抗氧化防御系統主要是由一些抗氧化因子構成，主要包括SOD、GSH-PX、CAT、GSH 以及 MDA 等，它們聯合作用保護機體免受氧化損傷。另外，水解酶活性受外源刺激或脅迫的誘導，這也可能是貝類具有可增強的抗性和對脅迫的耐受的原因。在水解酶類中，SOD和CAT是一類清除機體活性氧自由基的關鍵酶類，是抵抗超氧陰離子及其活性產物的第一道防線。正常情況下，機體的自由基含量處于動態平衡狀態。然而，環境脅迫時機體的抗氧化系統的平衡將被打破，造成水解酶活性升高。因此，抗氧化酶活性的變化也用作于指示應激的程度。對于CAT，本試驗中，鹽度15時活性最高，高于或低于此鹽度均有所降低，說明長期的鹽度脅迫對CAT有一定的抑制作用。

谷胱甘肽（GSH）在清除體內自由基和損傷修復中起重要的作用，是細胞合成的重要的抗氧化劑。MDA是機體內脂質氧化的產物，間接反映出細胞可能被氧化甚至損傷的程度。有研究表明酸性環境可以促進脂質的過氧化反應[18]。本試驗結果表明，瘤背石磺血淋巴MDA含量在鹽度25時最高，說明在此鹽度下，瘤背石磺脂質過氧化作用明顯增強，結合以上抗氧化酶活可以推斷，由于鹽度脅迫應激造成的MDA積累可能主要由于活性氧過量產生和積累，同時活性氧的清除體系——抗氧化酶活性低造成的。

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