一種食品中豬源性成分的快速檢測技術

李 鑫，孫甸甸，張慧娟，馮娜娜，尹秋源，尹 銳

（吉林農業科技學院，吉林132101）

1 前言

近年來，食品安全問題日益突出，其中肉及其制品的摻假現象十分嚴重，成為行業、消費者和研究人員關注的焦點。2013年西安通報了一起“9.10”特大制販假牛肉案，共查處17t假牛肉，這些假牛肉其實均為豬肉[1]。雖然食用豬肉不會對食品安全產生直接的影響，但是這揭示了食品供應鏈可追溯性存在的問題。豬肉由于價格相對便宜，一些商家為獲取暴利，將豬肉摻入牛、羊肉出售。這種行為嚴重擾亂了市場秩序；危害了消費者的健康和經濟利益；同時也造成一些宗教信仰方面的擔憂和恐慌[2]。因此，通過物種鑒別實驗對豬源性成分進行檢測尤為重要[3-5]。

基于蛋白質的檢測和DNA的檢測是動物源性成分鑒別的主要方法。基于蛋白質的檢測技術包括電泳分析法[6]、色譜分析法[7]和免疫分析法[8]等；肉制品中蛋白質會受到多種因素的影響，即使同一物種間也會存在一定的差異，且加工食品中蛋白質易發生變性而無法檢出。相對于蛋白質，DNA具有較高的熱穩定性和種屬特異性[9-10]。近年來，基于 DNA的方法，包括DNA雜交[11]、PCR-RFLP[12]和物種特異性PCR[13]等被用于動物源性成分的檢測研究。物種特異性PCR由于檢測快速，特異性強、靈敏性高的優勢，已經成為動物源性成分鑒定的主流方法[14]。

本研究根據豬線粒體cytb基因設計特異引物用于豬源性成分的檢測。為相關執法部門打擊不法商販、維護消費者合法利益提供有力科學依據。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

豬、羊、牛、雞、鵝、鴨肉均購置長春市某地方市場，購買后經形態鑒定。 豬肉火腿（n=4）、熟豬肉(n=7)、牛肉脯(n=6)、肉牛罐頭(n=9)、牛肉卷(n=7)購自某超市，同一種類的肉制品均來自不同的生產廠家。

PCR Master Mix試劑盒 (美國ABI公司);蛋白酶K;CTAB、EDTA、Tris-HCl、NaCl、氯仿、異戊醇、Tris 飽和酚、異丙醇、70%乙醇（均購自上海生物工程有限公司)。

2.2 方法

2.2.1 DNA提取 將豬肉樣品和其他肉制品剪碎，分別準確稱取各肉樣0.1g，液氮研磨后轉移至1.5mL離心管中，加入800μL 裂解液 (每 100mL 含 CTAB 1 g、EDTA 0.3722g、Tris-HCl 0.7882g、NaCl 4.09g,調至 pH8.0,高溫高壓滅菌)，65℃孵育 30 min，期間振蕩混勻3～4次，12000×g離心5min；上清液移入一潔凈離心管中，加入 400μL三氯甲烷-異戊醇(24∶1)，振蕩混勻后12000×g離心5min；取上清液于另一潔凈離心管中，加入320μL異丙醇，室溫沉淀30 min；12000×g離心5min，棄上清液，向沉淀中加入500μL 70%乙醇漂洗，12000×g離心5min，棄上清液，沉淀晾干，用20μL TE緩沖液溶解沉淀，經OD值測定后于-20℃保存。

2.2.2 特異性引物的設計 在GenBank中檢索豬線粒體cytb基因序列(accession KY432578.1)。用 DNAStar軟件設計特異性引物。對確定的基因特異引物經GeneBank (http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中Blast程序進行相似序列搜索后，確定其與常見動物源性成分無交叉反應，用于實驗。本研究的特異性引物序列如下，上游引物：5’-ATGAAACATTGGAGTAGTCCTACTATTTACC-3’ (31 bp,Tm 63.3℃),下游引物∶5’-CTACGAGGTCTGTTCCGATATAAGG-3’ (25 bp,Tm 64.6℃)；引物由上海生物工程有限公司合成。

2.2.3 PCR反應體系和反應條件 PCR反應體系∶其中PCR Master Mix 5.2μL,10μmol/L 引物各 0.8μL,模板 DNA 1μL,ddH2O 17.2μL，總體積 25μL。 反應條件如下∶95℃預變性 5min,95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,40個循環。

2.2.4 PCR產物的電泳檢測 將5μL PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上于110V下電泳30分鐘，凝膠成像系統記錄實驗結果。

2.2.5 靈敏度及特異性 為驗證該方法的靈敏性，用雙蒸餾水對純化的豬肉DNA進行10倍梯度稀釋，使每個PCR反應中的豬肉 DNA 含量分別為 10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg。PCR擴增后取上述PCR產物5μL經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。為驗證該方法的特異性，分別提取豬、羊、牛、雞、鵝、鴨肉基因組DNA，分別以1ng上述基因組DNA為模板進行PCR擴增，經電泳檢測以驗證該方法的特異性。

2.2.6 實際樣品的檢測 從超市購買銷售比例較大并標明成分的33份豬肉及牛肉制品,如2.1分別按上述方法提取其基因組DNA，通過豬源性PCR-電泳檢測以評價其在實際樣本檢測中的適用性。

3 結果與討論

3.1 特異性實驗

本研究根據豬線粒體cytb基因設計引物，分別對豬及其他5種動物源性成分（羊、牛、雞、鵝、鴨）的DNA樣本進行PCR擴增，擴增結果通過電泳檢測。僅豬DNA檢測結果呈陽性，其他對照以及空白對照均為陰性（如圖1）。因此，該方法具有較高的特異性。

3.2 靈敏性實驗

將純化的豬肉DNA進行10倍梯度稀釋，分別作模板進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，其靈敏度達到100pg（如圖2）。

3.3 商業樣品的檢測

從超市購買銷售比例較大并標明主要成分的33份豬肉及牛肉制品，用上述方法提取待測樣品DNA，通過豬源性成分PCR-電泳檢測，每個樣品做了一個平行樣。所有的豬肉制品檢測結果均為陽性；在部分牛肉罐頭、牛肉脯等干制品中檢測出豬源性成分，結果見表1。對檢測結果與商品標識不一致的樣品，對其PCR擴增產物進行基因測序，測序結果與預期的豬源性基因序列相符。因此，豬源性成分PCR-電泳檢測技術在商業樣本及復雜食物樣本的檢測中具有較高的準確性；另外，市場上存在牛肉制品摻假豬肉的現象，肉制品摻假確實是食品行業的一項重要問題。

4 結論

本研究將聚合酶鏈式反應和瓊脂糖凝膠電泳檢測相結合，建立了一種豬源性成分PCR-電泳檢測技術。該方法對豬源性成分的檢測具有較高的靈敏度和特異性，同時可用于商業樣本及復雜食物樣本的檢測，有望用于發展中國家和基層實驗室開展動物源性成分的快速檢測。另外，該方案可以根據其他物種特異基因進行修改，建立不同動物成分的PCR-電泳檢測技術，在肉及其制品的摻假、溯源中發揮重要的作用。

圖1 豬源性成分特異性結果

圖2 豬源性成分靈敏性結果

表1 肉制品中豬源性成分的檢出結果

[1]王海鵬.17.5噸假牛肉全是用豬肉做的 [N].西安晚報,2013-9-12(08).

[2]王瑞元,巢強國,葛宇,等.奶糖中豬成分明膠PCR鑒定方法的研究[J].食品工業,2010(1)：86-88.

[3]李巧玲，劉景艷.市場鮮豬肉摻假狀況的調查監測[J].食品科學，2004，25（10）：273-276.

[4]羅家琴，王加啟，卜登攀，等.飼料中牛，羊，豬，雞源性成分的 PCR 檢測方法及其應用 [J].中國農業科學，2008，41（7）：2112-2119.

[5]李家鵬，喬曉玲，田寒友，等.食品和飼料中動物源性成分檢測技術研究進展[J].食品科學.

[6]Renon,P.,Bernardi,C.,Scocca,S.,Cantoni,C.,Gridavilla,G.,2003.IEF(Iso-electricfocussing)and gas chromatography to identi2011，32 （9）：340-347.fy wild ruminant species.Indus.Aliment.42,496-500.

[7]Ashoor,S.H.,Monte,W.C.,&Stiles,P.G.(1998).Liquid chromatographic identification of meats.Journal-Association of Official Analytical Chemists,71(2),397-403.

[8]Hajmeer,M.,Cliiver,D.O.,&Provost,R.(2003).Spinal cord tissue detection in comminuted beef：comparison of two immunological methods.Meat Sciences,31(3),159-163.

[9]ARSLAN A,ILHAK O I,CALICIOGLU M.Effect of method of cooking on identification of heat processed beef using polymerase chain reaction (PCR)technique[J].Meat Science,2006,72(2)：326-330.DOI：10.1016/j.meatsci.2005.08.001.

[10]UNSELD M,BEYERMANN B,BRANDT P,et al.I-denti?cation of the species origin of highly processed meat products by mitochondrial DNA sequences[J].PCR Methods and Applications,1995,4：241-243.

[11]Chikuni,K.,Ozustume,K.,Hoishikawa,T.,&Kato,S.(1990).Species identification of cooked meats by DNA hybridization assay.Meat Science,27(2),199-208.

[12]NADIA H,IMAD N,AL-SAFADI B.Identification of meat species by PCR-RFLP of the mitochondrial COI gene[J].Meat Science,2011(90)：490-493.

[13]Karabasanavar,N.S.,Singh,S.P.,Umapathi,V.,Kumar,D.,Patil,G.,&Shebannavar,S.N.(2011).A highly specific PCR assay for identification of raw and heat treated mutton (Ovis aries).Small Ruminant Research,100(2),153-158.

[14]薛超波，王萍亞，李素芳，等.基于 PCR多物種鑒定技術及其在肉類鑒定中的應用 ［J］.食品安全質量檢測學報，2016，7（2）：562-566.