慢性乙型肝炎患者CD4+T細胞Foxp3基因甲基化狀態的研究

張君　李風　范玉琛　趙靜　李海銘　劉馨遠　田明明　高帥　于巖波　王凱

250012 濟南，山東大學齊魯醫院肝病科(張君、李風、范玉琛、趙靜、李海銘、劉馨遠、田明明、高帥、王凱)，消化內科(于巖波)；250012 濟南，山東大學肝病研究所(范玉琛、王凱)

全球大約有2.57億人感染了乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)[1]，HBV感染的臨床結局主要取決于病毒和宿主之間的相互作用[2]。CD4+CD25+調節性T細胞(regulatory T cells，Tregs)是機體重要的免疫調節細胞，與HBV感染慢性化有關[3-5]。叉頭框轉錄因子3(forkhead box protein 3，Foxp3)是Tregs的特異性轉錄因子，在Treg的發育、分化和功能維持等方面發揮重要作用[6]。研究表明，Foxp3基因的甲基化可調節Foxp3的基因表達，參與Treg細胞功能[7]。因此，本研究推測Foxp3基因甲基化狀態參與了慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的發病過程。本研究擬闡明外周血CD4+T細胞Foxp3基因甲基化狀態在慢性乙型肝炎患者中的表達規律。

1　材料與方法

1.1研究對象本研究選擇2014年9月至2015年1月在山東大學齊魯醫院就診的59例CHB患者，其中乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽性患者34例，HBeAg陰性患者25例，同時選擇22例健康體檢者作為對照(HCs)。根據2015年《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》，納入標準為乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和HBV DNA陽性6個月以上，血清HBeAg陽性或者陰性，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)持續或反復升高，或有肝組織學病變[8]。排除標準包括腫瘤病史、伴隨慢性丙型肝炎或人類免疫缺陷病毒感染、自身免疫性疾病、妊娠、糖尿病、藥物性肝炎、非酒精性脂肪肝、酒精性肝炎以及其他慢性肝病的病因。本研究經山東大學齊魯醫院倫理委員會批準，研究對象或家屬知情同意。

1.2外周血CD4+T細胞的分離分別抽取所有研究對象各20 ml外周靜脈血，使用淋巴細胞分離液(瑞典GE醫療集團)經密度梯度離心法分離得到外周血單個核細胞(PBMCs)。再利用磁珠(德國美天旎公司)分選出CD4+T細胞，并通過流式細胞術證實了CD4+T細胞的純度高于90%。

1.3流式細胞術分析將上述密度梯度離心所得到的PBMCs用抗人單克隆抗體CD4-PE和CD25-APC、FOXP3-FITC(美國eBioscience公司)進行染色。根據細胞固定/破膜試劑盒(美國eBioscience公司)說明書步驟對細胞進行洗滌，固定，破膜，染色。然后使用FACS Calibur(美國BD公司)分析細胞。最后用FlowJo 軟件(美國Tree Star Inc公司)計算出CD4+CD25+FOXP3+Tregs比例。

1.4實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)嚴格按照說明書用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)從CD4+T細胞中提取總RNA，并將RNA逆轉錄為cDNA。FOXP3基因的RT-qPCR上下游引物分別為5’-CAGCACATTCCCAGAGTTCCTC-3’和5’-GCGTGTGAACCAGTGGTAGATC-3’。β-Actin作為內參基因，其上下游引物分別為5’-ATGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’和5’-CTTCATG AGGTAGTCAGTCAGGTC-3’。RT-qPCR反應體系為20 μl:1 μl的cDNA、上下游引物各0.4 μl、10 μl SYBR@ PremixExTMTaq (日本TaKaRa公司)以及8.2 μl ddH2O。反應條件: 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環40 次；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s。β-Actin 作為內參計算目的基因mRNA相對表達水平。

1.5蛋白質印跡從CD4+T細胞中提取總蛋白，再用BCA測定試劑盒(上海碧云天公司)測定蛋白濃度。蛋白質通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后再轉移到聚乙二烯二氟化物膜上，并在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中進行封閉,然后用兔抗人Foxp3多克隆抗體(1∶2 000,英國Abcam 公司)孵化，4 ℃過夜，隨后用二抗羊抗兔抗體(1∶2 000，武漢博士德公司)在室溫下孵育1 h，通過增強化學發光檢測系統Image Quant LAS 4000 mini(美國通用電氣公司)使蛋白質條帶顯影，并使用Quantity One軟件(美國伯樂公司)進行蛋白定量。

1.6甲基化特異性聚合酶鏈反應用Trizol試劑從CD4+T細胞中提取基因組DNA。按照EZ DNA甲基化修飾試劑盒(美國ZYMO RESEARCH公司)說明書對基因組DNA進行亞硫酸鹽修飾。采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)方法檢測Foxp3甲基化狀態。其MSP的引物序列見表1[9]。總反應體系為25 μl：1 μl修飾后的DNA和上下游引物各0.5 μl，10.5 μl無核酸酶水，12.5 μl Premix Taq(美國Zymo research公司)。反應條件為：95 ℃預變性15 min； 95 ℃變性1 min, 60 ℃退火90 s和72 ℃ 延伸1 min, 35個循環；最后72 ℃ 延伸10 min。將7 μl PCR產物加入到2%瓊脂糖凝膠孔中電泳，在紫外燈下曝光，使用凝膠電泳圖像分析系統采集圖像并對結果進行分析。

1.7統計學方法所有數據均采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。定量數據以中位數(25%，75%)表示。分類數據以數字(%)表示。采用t檢驗或Mann-Whitney U檢驗來比較定量變量，卡方檢驗用于比較分類變量,使用spearman等級相關性檢驗來評估相關性。所有檢驗均為雙側，P<0.05為差異有統計學意義。

注：CHB，慢性乙型肝炎; HC，健康對照組圖1　不同研究人群之間外周血CD4+ T細胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例以及FOXP3表達的比較；CHB患者外周血CD4+ T細胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs細胞的比例和 FOXP3表達水平之間的關系Note: CHB, chronic hepatitis B; HC, healthy controlsFig.1　The comparison of frequency of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells and Foxp3 expression in peripheral CD4+ T cells in different populations. The percentage of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells was associated with the Foxp3 mRNA level in CD4+ T cells of CHB patients

2　結果

2.1CD4+T細胞中CD4+CD25+FOXP3+Tregs的比例HBeAg陽性患者CD4+T細胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例均明顯高于HBeAg陰性患者和HC[5.30%(3.73%，7.98%) vs 3.90%(3.10%，4.90%)，P=0.012；5.30%(3.73%，7.98%) vs 3.6%(2.75%，4.3%)，P=0.001圖1A]，然而HBeAg陰性患者與HC之間差異無統計學意義[3.90%(3.10%，4.90%) vs 3.6%(2.75%，4.3%)，P=0.263圖1 A]。

表1　用于MSP的FOXP3基因的引物序列

注：縮寫：enc=增強子;F=下游引物; Meth=甲基化; R=下游引物; Unmeth=非甲基化的

Note：Abbreviations: enc=enhancer;F=forward; Meth=methylated; R=reverse; Unmeth=unmethylated

注：Foxp3enc：Foxp3增強子; Foxp3cpg：Foxp3 CpG島; HC，健康對照組; M：甲基化; U：未甲基化; bp：堿基對圖2　不同研究人群之間 Foxp3enc和Foxp3cpg位點上的甲基化狀態，CHB患者CD4+ T細胞中CD4+CD25+Foxp3+ Tregs比例及Foxp3 mRNA水平與其基因甲基化狀態之間的關系Note: Foxp3enc, Foxp3 enhancer; Foxp3cpg, Foxp3 CpG island; HC, healthy control; M, methylated; U, unmethylated; bp, base pairsFig.2　The methylation status of Foxp3 at enhancer and CpG island sites in different populations.，and the relationship between the percentage of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory cells and Foxp3 mRNA level with the methylation status of Foxp3 at enhancer and CpG island sites in CD4+ T cells of CHB patients

2.2CD4+T細胞中Foxp3的表達與CD4+CD25+FOXP3+Tregs比例的關系與HBeAg陰性CHB患者及HC相比，HBeAg陽性CHB患者CD4+T細胞中Foxp3 mRNA水平明顯升高[0.0046(0.0040,0.0061) vs 0.0024(0.0022, 0.0041)，P=0.021；0.0046(0.0040,0.0061) vs 0.0017(0.0015,0.0030)，P=0.000，圖1B]，HBeAg陰性CHB患者也明顯高于HC[0.0024(0.0022,0.0041) vs 0.0017(0.0015,0.0030)，P=0.032圖1B]；Foxp3蛋白在HBeAg陽性CHB患者中也有明顯的上調[0.73(0.66,0.93)vs 0.49(0.41,0.66)，P=0.005；0.73(0.66,0.93)vs 0.45(0.37,0.55)，P=0.000，圖1C和1D]，在HBeAg陰性CHB患者與HC之間無明顯差異[0.49(0.41,0.66)vs 0.45(0.37,0.55)，P=0.536，圖1C和1D]。此外，通過spearman等級相關性檢驗發現CHB患者CD4+T細胞中Foxp3的表達水平與CD4+CD25+FOXP3+ Tregs細胞的比例呈正相關，即隨著Foxp3基因表達的升高，CD4+CD25+FOXP3+Tregs比例也增加(r=0.991，P=0.000,圖1E)。

圖3　慢乙肝患者HBV DNA水平與CD4+T細胞中Tregs比例,Foxp3 mRNA水平的關系Fig.3　Serum HBV DNA load was associated with the percentage of regulatory T cells and Foxp3 mRNA levels in CD4+ T cells of CHB patients

2.3CD4+T細胞中Foxp3的甲基化狀態與CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例及Foxp3mRNA水平之間的關系通過對Foxp3基因增強子(Foxp3enc)和CpG島(Foxp3cpg)位點上甲基化結果的分析，發現HBeAg陽性CHB患者Foxp3enc甲基化頻率顯著低于HC組35.3%[(12/22)vs 72.7%(16/22)，χ2=7.487，P=0.006，圖2B]，然而，HBeAg陰性患者Foxp3enc甲基化頻率與HBeAg陽性患者以及HC之間差異無統計學意義(52.0% vs 35,3%，P=0.199; 52.0% vs 72.7%，P=0.145，圖2B)。Foxp3enc甲基化組的Foxp3 mRNA水平和CD4+CD25+Foxp3+Tregs細胞的比例均顯著低于非甲基化組[0.0027(0.0016，0.0038) vs 0.0039(0.0021,0.0081)，P=0.023，圖2C；3.80(2.40，5.30) vs 6.80(4.60,8.75)，P=0.014，圖2D]。HBeAg陽性CHB患者中Foxp3cpg甲基化頻率也顯著低于HC[32.4%(11/34)vs 63.6%(14/22)，χ2=5.290，P=0.021，圖2E]，而HBeAg陰性患者Foxp3cpg甲基化頻率與HBeAg陽性患者以及HC之間差異均無統計學意義(44.0% vs 32.4%，P=0.361；44.0% vs 63.6%，P=0.179，圖2E)，Foxp3cpg未甲基化組Foxp3 mRNA水平和CD4+CD25+Foxp3+Tregs細胞的比例均顯著高于甲基化組[0.0026(0.0014,0.0037)對0.0041(0.0019,0.0080)，P=0.032，圖2F；3.90(2.40，5.00) vs 6.40[4.60,8.35)，P=0.018，圖2G]。Foxp3基因甲基化的典型MSP結果如圖2A所示。

2.4CD4+CD25+Foxp3+Treg比例以及FOXP3基因的表達和甲基化狀態與CHB患者臨床指標的關系59例CHB患者中，有35例患者血清HBV DNA載量> 1000 IU/ml,24例血清HBV DNA 載量< 1000 IU/ml。HBV DNA高載量(HBV DNA載量> 1000 IU/ml)的患者CD4+T細胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例和Foxp3 mRNA水平顯著高于HBV DNA低載量(HBV DNA 載量< 1000 IU/ml)的患者[5.00%(3.80%, 7.60%) vs 3.70%(2.95%, 5.08%),P=0.019; 0.0037(0.0024, 0.0080) vs 0.0024(0.0017, 0.0038),P=0.045] (圖3 A和3B)。HBV DNA高載量的患者FOXP3的甲基化頻率與HBV DNA低載量患者無明顯差別(Foxp3enc 34.3% vs 56.5%,P=0.129;Foxp3cpg 31.4% vs 45.8%，P=0.261)。

3　討論

Tregs是機體最重要的免疫調節細胞，在乙型肝炎的免疫調節中發揮重要作用[3-5]。研究表明，CHB患者外周血Tregs細胞比例的增加與HBV感染免疫耐受相關，參與了HBV感染的慢性化[4-5]。Foxp3是Tregs的特異性轉錄因子，在Tregs發育、分化和功能維持中起到決定性作用[6]。本研究發現CHB患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Tregs的比例以及Foxp3基因的表達水平均顯著高于正常對照組，這與之前的研究結果一致[4-5]，此外，通過spearman等級相關性檢驗發現CHB患者CD4+T細胞中Foxp3表達水平與CD4+CD25+FOXP3+ Tregs比例呈正相關，即隨著Foxp表達的升高，Tregs比例也增加,與之前的研究結果一致[6]，提示Foxp3基因表達水平的上調促進了CD4+CD25+Foxp3+ Tregs比例的增加，參與了HBV感染的發生發展過程。

DNA甲基化廣泛分布于人類基因組中，其主要發生在與鳥嘌呤相鄰的胞嘧啶(CpG二核苷酸)上，基因啟動子區域的DNA甲基化通常與基因沉默以及基因功能喪失有關[10]。Foxp3基因增強子區域存在一個Treg特異性去甲基化區域(treg-specific demethylated region, TSDR)，該區域的甲基化狀態與穩定Foxp3的表達以及維持CD4+CD25+Foxp3+ Tregs的功能密切相關[7]。Syed等[11]通過對花生過敏人群的脫敏口服免疫治療研究，發現與免疫不耐受患者相比，免疫耐受患者Foxp3啟動子區甲基化水平更低，Treg抑制功能更強；當患者停止免疫治療并再次對花生過敏時，Foxp3啟動子區域的甲基化水平相應增加，表明了Foxp3基因甲基化狀態可能與機體免疫耐受相關。在本研究中，我們通過MSP檢測CHB患者和HC組Foxp3enc以及Foxp3cpg位點的甲基化狀態，發現CHB患者Foxp3enc和Foxp3cpg位點的甲基化頻率均明顯低于健康對照，我們還發現Foxp3enc和Foxp3cpg位點甲基化組Foxp3的表達水平及CD4+CD25+Foxp3+ Tregs細胞的比例均明顯低于未甲基化組。這些結果提示，在CHB患者CD4+T細胞中Foxp3基因存在異常去甲基化，可能引起了Foxp3表達升高，進而引起CD4+25+Foxp3+Tregs比例的增加，參與機體對HBV感染免疫耐受機制而導致病程的慢性化。

此外，我們還發現血清HBeAg陽性、HBV DNA高載量(HBV DNA>1000 IU/ml)與CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例及FOXP3表達升高有關，這些結果與之前的研究結果一致[5]，提示CD4+CD25+Foxp3+Tregs可能與HBV病毒復制和持續存在有關。我們還發現與HBeAg陰性和HBVDNA低載量患者相比，血清HBeAg陽性或HBV DNA高載量患者Foxp3的甲基化頻率均降低，但無統計學意義，這可能是由于研究樣本量相對較小和(或)MSP為定性檢測有關。同時，本研究為探索性研究，對Foxp3基因甲基化如何影響Foxp3表達的分子機制，需要進一步研究。

綜上所述，本研究發現CHB患者CD4+T細胞中Foxp3基因存在異常去甲基化，與Tregs細胞比例和Fxop3表達有關，共同參與了慢性乙型肝炎的免疫過程。

利益沖突:無

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