山東省蚊蟲中以基因1型乙型腦炎病毒流行為主

張維嘉　林小娟　劉愛國　付士紅　劉桂芳　邵楠　王倩瑩　陶澤新　何英　雷雯雯

梁國棟　徐愛強　趙麗　王環宇

乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是一種可引起人類嚴重神經系統疾病傳染病的蟲媒病毒。 JEV引起的乙型腦炎(Japanese encephalitis, JE)，主要流行在亞洲、西太平洋地區及澳洲北部地區，每年報告約50 000腦炎病例，病死率高達20%～30%，中國報告病例數幾乎占世界范圍病例總數的一半[1]。乙腦是我國法定乙類傳染病之一，是我國重要的病毒性腦炎疾病，隨著乙腦疫苗納入計劃免疫，發患者數顯著下降。

山東省歷史上是乙腦流行大省，自1986年將乙腦疫苗納入兒童計劃免疫后，發病數逐年下降，但部分地區仍然發生乙腦的暴發疫情[2]，2013年山東省出現乙腦大規模暴發流行，并曾從蚊蟲標本中分離得到多株JEV[3-4]。為掌握目前當地蚊蟲中攜帶乙腦情況及目前乙腦毒株變化情況，于2016年在山東省三個地區采集蚊蟲標本并分離病毒，對病毒分子特征進行深入分析，結果報道如下。

1　材料與方法

1.1蚊蟲標本的采集2016年8—9月在山東省微山縣、莒南縣、墾利縣的豬圈中使用紫外誘蚊燈(“功夫小帥”牌，武漢市吉星環保科技有限責任公司產品)和電動吸蚊器采集蚊蟲標本。使用紫外誘蚊燈采集時間為晚上19:00至次日7:00，電動吸蚊器采集時間為日落前至晚上20:00。蚊蟲標本在-20 ℃冰箱內冷凍1 h，在冰排上剔除雄蚊，蚊蚡類后按照蚊子形態學特點對雌蚊分類，按照采集地區與蚊蟲種類裝入凍存管，50～120只/批，凍存保存于液氮罐中。

1.2蚊蟲處理與病毒分離從液氮罐中取出裝有蚊蟲的凍存管，迅速將蚊蟲倒入加有5 mm滾珠的2 ml Eppendorf 管中，每管加入1.5 ml 研磨液(含5%青霉素、鏈霉素、1% 谷氨酰胺的MEM培養液)，在組織震蕩儀上以25次/s頻率震蕩3 min 后以4 ℃，15 000×g離心30 min。取80 μl 研磨上清液感染生長至70%～80%的單層BHK-21和C6/36細胞，吸附1 h后，棄掉上清，加入1 ml細胞維持液，分別置于37 ℃和28 ℃培養箱，逐日觀察細胞病變情況。盲傳3代，無病變者舍棄。對出現病變的樣品繼續傳代，直至出現規律病變后凍存。

1.3分子生物學檢測取140 μl蚊蟲研磨上清液，用QIAamp? Viral RNA提取試劑盒(Qiagen公司)提取RNA，利用隨機引物p(dN)6 和Ready-to-GoTM You prime First-Strand Beads 試劑盒(GE Healthcare 公司)制備cDNA文庫。使用本科室自行設計的JEV 型特異性引物及探針進行熒光RT-PCR檢測。同時對細胞感染出現的陽性分離株提取病毒RNA，反轉錄為cDNA后，參照文獻[5]中使用的JEV特異性引物進行PCR檢測，對得到的陽性PCR樣品進行回收，送梓熙生物公司進行序列測定。

1.4系統進化分析使用Clustal X2.09軟件完成序列比對，Bioedit進行序列編輯，MegAlign軟件完成病毒核苷酸和氨基酸同源性分析，使用Mega 5.0 軟件繪制JEV系統發生樹(Neighbor-Joining方法)，Bootstrap值設定為1 000。繪制系統發生樹所選用的其他病毒株包含JEV的五種基因型別，外群基因MVE-1-51為墨累山谷腦炎病毒(Murray Valley encephalitis virus, MVEV)(表1)。

2　結果

2.1蚊蟲標本采集2016年8月30日至9月7日，在山東省微山縣、莒南縣、墾利縣共采集蚊蟲標本8 418只，其中三帶喙庫蚊(Culextritaeniorhy-nchus)共3 535只占41.99%，中華按蚊(Anophelessinensis)共1 883只占22.37%，騷擾阿蚊(Armigeresobturbans)共3 000只占35.64%。

2.2病毒分離蚊蟲標本共分為81批進行研磨處理，研磨上清液接種細胞，獲得8株能夠引起BHK-21細胞規律病變的陽性分離物，編號為SDJN1633、SDJN1635、SDJN1646、SDWS1607、 SDWS1614、SDWS1615、SDWS1617、SDWS1619。

2.3分子生物學檢測使用基于JEV E基因特異性引物對8株陽性分離物的cDNA進行序列擴增。對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示該8株分離物在約1 500 bp有目的核酸片段，測序后比對分析發現該8株陽性分離物均為基因Ⅰ型JEV。81批蚊蟲標本中，實時熒光RT-PCR法共檢測出23批陽性，陽性率為28.4%。所有陽性標本均是從三帶喙庫蚊中獲得(表2)。

表1　本研究中采用乙腦病毒序列背景信息

注：a：為本次新分離乙型腦炎病毒株b☆：MVE-1-51為進化分析時所用外群

Notes：a：JEV strains isolated in this studyb：MVE-1-51 was used as an outgroup in all phylogenetic analyses

表2　2016年山東省蚊蟲標本中乙型腦炎病毒分離及檢測

注：a每批指蚊蟲研磨時，50-120只/研磨管，一管為一批；“—”：代表沒有采集到該蚊種

Note:aMosquitoes were homogenized in 50-120 individuals per pool; “—”: No collection of this mosquito species

2.4新分離JEV系統進化分析對得到的8株新分離JEV進行E基因序列測序，與GenBank中收錄的不同型別、不同國家的JEV序列E基因核苷酸序列做系統進化分析。構建基于Neighbor-Joining方法的核苷酸系統進化樹。新分離的8株病毒與山東省分離得到的JEV均屬于基因Ⅰ型乙腦病毒(KL78/SD/CHN/13、VN11/SD/CHN/13、SD0810、RC34/SD/CHN/13)且同屬一個支進化分支(圖1)[3-4]。新分離8株乙腦病毒與山東省以往分離的乙腦病毒之間的核苷酸和氨基酸同源性分別為98.3%～99.4%和99.6%～100%。

注：黑色三角形代表本研究分離的8株JEV圖1　山東省乙腦病毒E基因系統進化分析Note: Black triangles represents the 8 strains of JEV isolated in this studyFig.1　Phylogenetic analysis of JEV isolated from Shandong

3　討論

JEV又稱日本腦炎病毒，因其在日本暴發并首次分離到該病毒而命名。患者感染JEV后，大部分表現為非特異性癥狀如發熱、頭痛、咳嗽等，但是一旦病毒侵入神經系統，會引發嚴重的中樞神經系統損傷甚至死亡，在兒童中神經系統后遺癥出現的概率為30%[6]。山東省1986年將乙腦疫苗納入兒童計劃免疫后，乙腦的流行強度逐年下降[7]。但是近年來流行特征發生改變，出現以成人病例為主的乙腦暴發流行[8]。

乙腦傳播途徑主要以蚊—豬(鳥)—蚊為主，人是終末宿主，環境中的蚊媒密度與乙腦的感染概率關系密切，庫蚊屬蚊蟲是山東省的優勢蚊種，其中又以三帶喙庫蚊為主[9]。本次調查結果也反映出三帶喙庫蚊在數量上的優勢。并且分離的和核酸檢測陽性的標本均來自三帶喙庫蚊，進一步證實三帶喙庫蚊是攜帶和傳播乙型腦炎病毒最主要的媒介。

JEV主要以乙腦病毒E基因區段作為靶點基因[10]。本研究通過對JEV E基因序列進行進化分析，發現新分離JEV均為基因Ⅰ型，與之前山東省蚊蟲中分離的JEV一致[3,11]，說明基因Ⅰ型乙腦病毒是目前山東省流行的主要型別，與我國及亞洲目前流行基因型別一致[12]。此外，進化分析顯示山東省新分離JEV均聚集在一起，且與之前在山東省分離到的JEV親緣關系最近，說明山東省內JEV的遺傳進化較為保守，在當地形成穩定的自然循環圈。

利益沖突:無

[1]Campbell GL，Hills SL，Fischer M，et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis[J]. Bull World Health Organ，2011，89(10): 766-774.DOI:10.2471/BLT.10.085233.

[2]林小娟，劉桂芳，張麗，等. 山東省1986～2010年流行性乙型腦炎流行病學特征分析[J]. 現代預防醫學, 2013,40(13): 2389-2391.DOI:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2009.04.002.

[3]高曉艷，王海巖，王環宇，等. 山東省新分離乙腦病毒(SD08-10株)全基因組序列特征[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志，2009，23(4): 242-244.DOI:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2009.04.002.

[4]Tao ZX，Liu GF，Wang M，et al. Molecular Epidemiology of Japanese Encephalitis Virus in Mosquitoes during an Outbreak in China，2013[J]. Sci Rep，2015，4. DOI: 10.1038/srep04908.

[5]Wang HY，Takasaki T，Fu SH，et al. Molecular epidemiological analysis of Japanese encephalitis virus in China[J]. J Gen Virol，2007，88(3): 885-894.DOI: 10.1099/vir.0.82185-0.

[6]Solomon T，Vaughn DW. Pathogenesis and clinical features of Japanese encephalitis and West Nile virus infections[J]. Curr Top Microbiol Immunol，2002，267: 171-194.DOI:10.1007/978-3-642-59403-8.

[7]徐愛強，劉桂芳，宋立志，等. 現階段山東省乙腦流行因素的探討[J]. 預防醫學文獻信息，1996，2(2): 129-130.DOI:10.16406/j.pmt.issn.1672-9153.1996.02.034.

[8]尹遵棟，湯伯明，唐曉燕，等. 以大年齡病例為主的流行性乙型腦炎發病危險因素的病例對照研究[J]. 中國疫苗和免疫，2013，19(3): 235-239.

[9]楊培培，李文娟，程鵬，等. 山東省南水北調沿線蚊類密度及流行性乙型腦炎病毒自然感染狀況研究[J]. 中國媒介生物學及控制雜志，2016，27(3): 232-234,240.

[10]Zheng YY，Li MH，Wang HY，et al. Japanese encephalitis and Japanese encephalitis virus in mainland China[J]. Rev Med Virol，2012，22(5): 301-322.DOI: 10.1002/rmv.1710.DOI:1-.1002/rmv.1710.

[11]王海巖，高曉燕，宋立志，等. 山東省首次分離出基因1型流行性乙型腦炎病毒[J]. 中國疫苗和免疫，2009，15(4): 337-340.

[12]Gao XY，Li XL，Li MH，et al. Vaccine strategies for the control and prevention of Japanese encephalitis in Mainland China, 1951-2011[J]. PLoS Negl Trop Dis，2014，8(8): e3015. DOI: 10.1371/journal.pntd.0003015.DOI:10.1371/journal.pntd.000315.