利用光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)方法研究發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒核蛋白的亞細(xì)胞定位

牛國宇　張尊　夏百成　劉淑慧　高旭　蕪為　鄒小輝　魯茁壯　洪濤

261053 濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院(牛國宇、夏百成、劉淑慧、高旭)；100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(張尊、蕪為、鄒小輝、魯茁壯、洪濤)；475000 開封，河南化工技師學(xué)院(張尊)

發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)是一種新發(fā)出血性傳染病，該病以發(fā)熱、血小板減少為主要特征，大多數(shù)患者有惡心、嘔吐及食欲不振等消化道癥狀，少數(shù)重癥患者可因多臟器損害而死亡，病死率在10%至30%之間[1]。SFTS的病原體為發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)，隸屬布尼亞病毒目phenuiviridae病毒科，是白蛉病毒屬中的一個(gè)新的種，基因組由大(L)、中(M)、小(S)3個(gè)節(jié)段組成。L節(jié)段編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)，M節(jié)段編碼膜糖蛋白(G)，S節(jié)段編碼核蛋白(NP)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NSs)。核蛋白NP在病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制等方面發(fā)揮重要作用[2]。目前研究病毒蛋白在亞細(xì)胞水平(胞核、胞質(zhì)及胞膜)的分布主要借助熒光標(biāo)記技術(shù)[3]，但熒光顯微鏡分辨能力有限，如要進(jìn)一步定位到細(xì)胞器，需借助免疫電鏡，而免疫電鏡不僅操作繁瑣，且具有一些無法回避的缺陷，比如固定劑會(huì)破壞蛋白；制備蛋白抗體困難；膠體金顆粒只能標(biāo)記蛋白大概位置等[4]。因此，觀察病毒蛋白在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的分布需利用新的電鏡標(biāo)記技術(shù)。

MiniSOG(mini Singlet Oxygen Generator)是近年來興起的一種蛋白標(biāo)記技術(shù)[5]。miniSOG僅含有106個(gè)氨基酸，分子量不到GFP大小的一半，在熒光顯微鏡下可以像GFP一樣發(fā)射綠色熒光；在藍(lán)光的激發(fā)下并有氧氣存在時(shí)，產(chǎn)生的單線態(tài)氧能夠催化二氨基聯(lián)苯胺(DAB)聚合形成嗜鋨顆粒，用四氧化鋨固定電鏡標(biāo)本時(shí)，DAB聚合物吸附鋨顆粒，在透射電鏡下深染色而被電鏡解析。本研究利用我們前期構(gòu)建的基于miniSOG的光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)方法[6]，在超微結(jié)構(gòu)水平觀察不同時(shí)相下SFTSV核蛋白NP在宿主細(xì)胞中的表達(dá)、定位情況，分析其與重要細(xì)胞器高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的關(guān)系，并描述亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)一步分析核蛋白NP形成包涵體的特點(diǎn)，為研究核蛋白NP在SFTSV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄中的作用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料293細(xì)胞為本室保存，pcDNA3-miniSOG為克隆有miniSOG基因的pcDNA3質(zhì)粒以及攜帶miniSOG編碼區(qū)的pTPL-IXSOG質(zhì)粒均為本室前期構(gòu)建[6]。pcDNA3-TPL質(zhì)粒為CMV啟動(dòng)子下游含41型腺病毒三連體前導(dǎo)序列TPL的pcDNA3質(zhì)粒(TPL有利于提高目的基因表達(dá))。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3 000購自美國Life technologies公司。Q5高保真DNA聚合酶為美國NEB公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶KpnI，XbaI，NcoI為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。戊二醛、二甲胂酸鈉、醋酸雙氧鈾、四氧化鋨、環(huán)氧樹脂Epon-812為美國SPI公司產(chǎn)品。PCR引物由北京六合華大基因有限公司合成。NP蛋白及NP蛋白兔抗血清由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所出血熱室惠贈(zèng)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2攜帶NP-miniSOG融合蛋白基因(NPSOG)的pTPL-NPSOG質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定使用Q5高保真DNA聚合酶，以SFTSV-S片段為模板，以1709NPF1：5′-GCGCGGTACCATGTCGGAGTGGTCCAGGA -3′和1709NPR1：5′-CATCGTCATCCTTATAATCGGCAGACAGGTTTCTGTAAGCAGCAGCAGCA-3′為引物擴(kuò)增NP基因；以pTPL-IXSOG為模板，以1709NPF2：5′-TGCTGCTGCTGCTTACAGAAACCTGTCTGCCGATTATAAGGATGACGATG-3′與1709NPR2：5′-GGCCTCTAGACTAGCCATCCAGCTGCACACCAAT-3′為引物擴(kuò)增miniSOG基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收后作為擴(kuò)增模板，以1709NPF1和1709NPR2為引物，經(jīng)重疊延伸PCR(overlap extension PCR)方法擴(kuò)增NP與miniSOG的融合基因(NPSOG)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，經(jīng)KpnI與XbaI雙酶切并與經(jīng)同樣雙酶切的pTPL-IXSOG載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，得到pTPL-NPSOG質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)NcoI酶切鑒定后，選取鑒定正確的質(zhì)粒用于測序驗(yàn)證。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及NPSOG蛋白檢測使用Lipofectamine 3 000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，參照說明書進(jìn)行操作，將1 μg pTPL-NPSOG轉(zhuǎn)染至12孔板293細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后24 h、36 h、48 h分別在熒光顯微鏡下觀察NPSOG蛋白表達(dá)情況。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上后，5%脫脂奶封閉1 h，加入NP蛋白的兔抗血清(1∶2 500)室溫孵育1 h；PBS洗膜3次(10 min/次)；加入 HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2000)，室溫孵育1 h；PBS洗膜3次(10 min/次)，檢測。

1.4光氧化實(shí)驗(yàn)及電鏡樣品制備與觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，于不同時(shí)間點(diǎn)(24 h、36 h、48 h)，利用熒光指示定位NPSOG表達(dá)細(xì)胞，選取不同時(shí)相的NPSOG熒光陽性細(xì)胞，參照我們前期建立的方法進(jìn)行光氧化反應(yīng)及制備電鏡樣品[6]。樣品制備后使用 Tecnai 12透射電鏡觀察。

2　結(jié)果

2.1pTPL-NPSOG質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定經(jīng)PCR擴(kuò)增分別得到長度為770 bp的NP基因及392 bp的miniSOG基因，電泳回收后，二者共同作為模板，重疊延伸PCR擴(kuò)增獲得長度為1 112 bp的NPSOG，該片段中miniSOG基因融合在NP基因3′端，二者融合表達(dá)。經(jīng)酶切連接操作，NPSOG片段克隆至pcDNA3-TPL載體，得到pTPL-NPSOG質(zhì)粒，經(jīng)NcoI酶切鑒定，電泳結(jié)果表明質(zhì)粒構(gòu)建正確，質(zhì)粒經(jīng)北京六合華大基因有限公司測序驗(yàn)證序列無誤后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2Westernblot檢測NPSOG蛋白的表達(dá)收獲轉(zhuǎn)染pTPL-NPSOG質(zhì)粒48 h后的293細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示(圖1)，轉(zhuǎn)染pTPL-NPSOG質(zhì)粒的細(xì)胞樣品在40 ×103處呈現(xiàn)單一的目的條帶(泳道2)，而未添加miniSOG標(biāo)簽的NP蛋白在25 ×103處呈現(xiàn)單一的目的條帶(泳道1)，兩者大小均與預(yù)期結(jié)果相符，表明miniSOG標(biāo)簽蛋白與NP蛋白成功連接，NPSOG蛋白在293細(xì)胞中正確表達(dá)。

1:NP蛋白；2：NPSOC蛋白圖1　NPSOG蛋白表達(dá)的檢測1: protein of NP; 2: protein of NPSOGFig.1　Determination of NPSOG by western blot

2.3光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)方法觀察NPSOG蛋白的表達(dá)情況pTPL-NPSOG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48 h(圖1A)，熒光顯微鏡下定位表達(dá)NPSOG蛋白的熒光細(xì)胞(圖2B)，細(xì)胞固定后進(jìn)行DAB光氧化反應(yīng)，可見表達(dá)NPSOG的細(xì)胞(熒光細(xì)胞)結(jié)構(gòu)顏色變黃，而不發(fā)射綠色熒光的結(jié)構(gòu)(不表達(dá)NPSOG蛋白)并未見到明顯的顏色變化(圖2C)。光氧化后再經(jīng)OsO4后固定，可見表達(dá)NPSOG蛋白的熒光細(xì)胞顏色變成深褐色(圖2D)。制備成超薄切片后，使用電鏡觀察，可見表達(dá)NPSOG蛋白的細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈深色，而光鏡下無熒光的細(xì)胞結(jié)構(gòu)顏色較淺，顏色深淺區(qū)別明顯，容易辨別(圖2F)。提高放大倍數(shù)后，可見表達(dá)NPSOG蛋白的細(xì)胞內(nèi)有多處深色成簇聚集現(xiàn)象(圖2E)，說明NPSOG蛋白能夠形成片狀或塊狀聚集，而鄰近質(zhì)粒未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中由于沒有NPSOG蛋白的表達(dá)，因此沒有見到該現(xiàn)象。

293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pTPL-NPSOG質(zhì)粒后48 h(A),在熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)綠色熒光(B);經(jīng)2.5%戊二醛固定，DAB光氧化(C),1%四氧化鋨固定(D)并制備成超薄切片后于電鏡下觀察(F)。E:圖F中方框內(nèi)區(qū)域放大后的圖像。Cy:細(xì)胞漿，N:細(xì)胞核，IB:包涵體圖2　光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)方法觀察NP與miniSOG融合蛋白(NPSOG)在細(xì)胞內(nèi)的定位Cy: Cytoplasm, N: Nucleus, IB: Inclusion bodies. The 293 cells were transfected with plasmid of pTPL-NPSOG, and observed under light microscope using bright field (A) or fluorescence (B) at 48 h post-transfection. Cells were fixed in 2.5% glutaraldehyde in situ, stained with DAB through photooxidation (C), post-fixed in 1% osmium tetroxide (D), and used to prepare ultrathin sections which were observed under transmission electron microscope(F), E:Enlargement of the region boxed in (F)Fig.2　Intracellular location of NPSOG protein with correlative light microscopy (LM) and electron microscopy (EM)

293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pTPL-NPSOG質(zhì)粒后48 h(A),在熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)綠色熒光(B);經(jīng)細(xì)胞經(jīng)2.5%戊二醛固定，DAB光氧化及1%四氧化鋨后固定制備超薄切片并在電鏡下觀察。A:pcDNA3-miniSOG轉(zhuǎn)染后48 h；B:pTPL-NPSOG轉(zhuǎn)染后24 h;C:pTPL-NPSOG轉(zhuǎn)染后48 h。圖A中*號指示的是表達(dá)miniSOG蛋白的細(xì)胞。N：細(xì)胞核；G:高爾基體；M:線粒體；ER:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；IBF:包涵體圖3　轉(zhuǎn)染不同時(shí)相的miniSOG或NPSOG蛋白表達(dá)情況Cells were fixed in 2.5% glutaraldehyde in situ, stained with DAB through photooxidation, post-fixed in 1% osmium tetroxide, and used to prepare ultrathin sections which were observed under transmissionn electron microscope after transfecting with plasmid of pcDNA3-miniSOG for 48 h (A) or pTPL-NPSOG for 24 h (B), 36 h (C) and 48 h (D), respectively. A: * indicates the cell expressing protein miniSOG. N: Nucleus, G: Golgi apparatus, M: Mitochondrion, ER: Endoplasmic Reticulum, IB: Inclusion bodiesFig.3　The expression of miniSOG or NPSOG protein in different transfection phases

2.4不同時(shí)相核蛋白NP形成包涵體的電鏡觀察為了觀察不同時(shí)間點(diǎn)NPSOG蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況，我們分別在轉(zhuǎn)染后24 h、36 h、48 h對細(xì)胞進(jìn)行光氧化并制樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染24 h(圖3B)，胞漿內(nèi)可見清晰的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器，胞漿及核周出現(xiàn)散在的點(diǎn)狀核蛋白，部分蛋白周圍可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體附著，且蛋白有聚集的趨勢；轉(zhuǎn)染36 h(圖3C)及48 h(圖3D)，核蛋白在核周聚集成塊狀包涵體樣結(jié)構(gòu)，除線粒體外，未在包涵體周圍觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等其他細(xì)胞器的附著，也未見其他明顯的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變。而pcDNA3-miniSOG轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，miniSOG蛋白均勻分布于細(xì)胞內(nèi)(圖3 A)。結(jié)果表明，293細(xì)胞胞漿內(nèi)核蛋白NP數(shù)量積累到一定程度，就會(huì)聚集形成塊狀包涵體樣結(jié)構(gòu)。

3　討論

布尼亞病毒基因組以核糖核蛋白復(fù)合物形式存在，核蛋白NP在病毒顆粒內(nèi)通過與病毒基因組RNA和RNA聚合酶結(jié)合形成NP體(ribonucleopro-tein, RNP)，除了具有保護(hù)作用外，同時(shí)又具有同型寡聚化和與RNA結(jié)合的特性，這些特性使得核蛋白NP在病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及病毒顆粒的組裝過程中發(fā)揮重要作用。miniSOG蛋白不但可以在藍(lán)光激發(fā)下呈現(xiàn)綠色熒光，而且經(jīng)DAB和OsO4固定染色后可以被電鏡解析，因此，經(jīng)miniSOG標(biāo)記的SFTSV核蛋白可以從更微觀的水平對其與細(xì)胞的相互作用進(jìn)行研究。

多種細(xì)胞系對SFTSV敏感，如非洲綠猴腎細(xì)胞系Vero、人巨噬細(xì)胞THP-1細(xì)胞、人腎上皮細(xì)胞293細(xì)胞等[7-8]。本研究采用293細(xì)胞作為核蛋白NP表達(dá)、定位研究細(xì)胞系。將成功構(gòu)建并鑒定無誤的pTPL-NPSOG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，得到了相關(guān)蛋白，并通過Western blot進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明兩種蛋白大小符合預(yù)期，說明miniSOG標(biāo)簽已成功添加到SFTSV核蛋白NP，且該標(biāo)簽未對NP蛋白的抗原性造成影響。

通過免疫熒光的方法來研究原布尼亞病毒科病毒蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布情況已有許多報(bào)道，如有研究發(fā)現(xiàn)裂谷熱病毒Gc蛋白上有特異性甘油磷脂識(shí)別區(qū)域來驅(qū)動(dòng)靶膜的插入[9]；漢坦病毒核衣殼蛋白和Gc蛋白在細(xì)胞內(nèi)集聚可以幫助Gn蛋白形態(tài)穩(wěn)固和功能發(fā)揮等[10]。但共定位技術(shù)需要對不同蛋白、細(xì)胞器等進(jìn)行熒光染色標(biāo)記、漂洗，共聚焦時(shí)像素的強(qiáng)弱、背景信號及熒光分辨率等原因，可能會(huì)產(chǎn)生干擾現(xiàn)象。而mimiSOG標(biāo)簽分子量小，相關(guān)基因與目的基因融合操作簡單，質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞表達(dá)后可直接進(jìn)行細(xì)胞切片，可以避免熒光染色、圖像復(fù)合等步驟干擾，在電鏡觀察病毒蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位分布方面有較高的應(yīng)用價(jià)值。本研究利用該技術(shù)成功建立了針對SFTSV核蛋白NP的光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)方法，通過熒光顯微鏡初步定位了表達(dá)NPSOG蛋白的細(xì)胞，進(jìn)而通過電鏡更為清晰地觀察蛋白的亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)運(yùn)情況，以及相關(guān)細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)改變。

通過觀察NPSOG蛋白轉(zhuǎn)染后不同時(shí)相(24 h、36 h、48 h)的特征，我們發(fā)現(xiàn)隨著質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后時(shí)間的延長和NPSOG蛋白表達(dá)的增加，宿主細(xì)胞胞漿及核周開始出現(xiàn)散在的、體積較小的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，并逐漸聚集，最終在轉(zhuǎn)染后36 h及48 h在胞漿中形成體積較大、形狀不規(guī)則的聚集性結(jié)構(gòu)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這種結(jié)構(gòu)很可能是由病毒蛋白形成的包涵體結(jié)構(gòu)[11-12]。包涵體類似病毒工廠，許多病毒為了提高復(fù)制和組裝效率，往往會(huì)利用宿主細(xì)胞器和某些蛋白在胞內(nèi)形成一個(gè)聚集病毒成分的特殊結(jié)構(gòu)，達(dá)到高效復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、組裝的目的[13]。布尼亞病毒科其他成員也能形成包涵體，例如漢坦病毒(HTNV)可在胞內(nèi)形成顆粒狀或絲狀包涵體；拉克羅斯病毒NP蛋白在宿主細(xì)胞核周形成包涵體樣結(jié)構(gòu)[14-15]。研究結(jié)果顯示：(1)單獨(dú)表達(dá)SFTSV核蛋白NP即可形成包涵體樣結(jié)構(gòu)，沒有其他病毒蛋白協(xié)助，可能是核蛋白NP具有定向聚集或包涵體形成信號；(2)包涵體的形成需要一定數(shù)量的核蛋白NP的積累與聚集，核蛋白表達(dá)后定向移動(dòng)，逐漸累積，最終形成一個(gè)體積較大的聚集性結(jié)構(gòu)。因此，通過單獨(dú)對SFTSV核蛋白的電鏡觀察及性質(zhì)研究，我們不僅避免了活病毒的操作，也屏蔽了病毒其他蛋白之間相互作用帶來的影響，有利于核蛋白自身性質(zhì)的研究，為下一步SFTSV其他結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白的研究打下了基礎(chǔ)。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)293細(xì)胞在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，胞漿及核周開始出現(xiàn)散在的點(diǎn)狀蛋白，蛋白周圍可見一定數(shù)量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，這可能與NPSOG蛋白的合成修飾有關(guān)，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見明顯改變；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，胞漿及核周點(diǎn)狀蛋白消失，代之以一個(gè)或幾個(gè)較大的聚集性結(jié)構(gòu)，且遠(yuǎn)離胞核，胞漿中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體數(shù)量減少，這可能是由于NPSOG蛋白聚集形成包涵體作為病毒工廠時(shí)吸納了部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器，而包涵體染色較深，導(dǎo)致細(xì)胞器被覆蓋而無法觀察所致。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體是病毒成熟包裝的重要場所，提示SFTSV核蛋白聚集形成包涵體結(jié)構(gòu)可能是SFTSV復(fù)制周期中的必需環(huán)節(jié)，與病毒包裝成熟密切相關(guān)。

綜上所述，本研究通過電鏡直接觀察到了SFTSV核蛋白NP在293細(xì)胞中的表達(dá)、定位及形態(tài)特點(diǎn)，并通過觀察不同時(shí)相下亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變，描述了核蛋白NP所形成包涵體的特征，為進(jìn)一步理解SFTSV胞內(nèi)復(fù)制組裝提供了線索。

利益沖突：無

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