甲型肝炎病毒疫苗株H2株的連續(xù)傳代及其基因穩(wěn)定性

王東寶　曹晗　鄭勇　史小軍　馬忠飛　段穎融　鄧燕　孫明波

650118 昆明，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

甲肝病毒(hepatitis A Virus)是一類能夠引起人類肝功能異常的小RNA病毒，由它導(dǎo)致的傳染病稱為甲型肝炎，此病傳播速度快，在所有肝炎中發(fā)病率最高，從90年代開始流行較為嚴(yán)重，導(dǎo)致數(shù)百萬人發(fā)病，給患者和國家造成極大和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，影響較為嚴(yán)重。[1]。

1992年,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所(以下簡稱：生物所)與浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國食品藥品檢定研究院三家單位共同合作,開發(fā)研制出甲型肝炎減毒活疫苗(H2株)，該疫苗是我國首創(chuàng)，成功地控制了甲肝流行，取得了顯著的社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)效益[2-3]。目前生物所生產(chǎn)的甲肝疫苗采用的是甲肝病毒H2株[4]進(jìn)行生產(chǎn)，此毒株于1982年分離自我國杭州市郊農(nóng)村一名12歲男性甲肝患者的糞便，經(jīng)原代猴腎細(xì)胞傳20代，人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17傳5代獲得，經(jīng)檢定合格，用于疫苗生產(chǎn)。由于毒株是HAV野毒株經(jīng)體外細(xì)胞傳代適當(dāng)減毒獲得，根據(jù)疫苗生產(chǎn)的相關(guān)要求，用于生產(chǎn)活疫苗的毒種，必須保持減毒株的特性，其致病性的毒力和免疫原性應(yīng)相對穩(wěn)定，毒力不應(yīng)當(dāng)隨著傳代發(fā)生“返祖”或降低，尤其是重要毒力相關(guān)位點(diǎn)不能夠發(fā)生重大突變。因此，在疫苗生產(chǎn)過程中，研究H2株毒種的遺傳基因是否發(fā)生較大變異，具有重大的意義。

以往對HAV病毒基因的研究[5-8]都是采用一代測序原理 (即sanger 測序)，進(jìn)行部分片段或全基因組測序。這種直接測序方法具有高度的準(zhǔn)確性和簡單、快捷等特點(diǎn)，但由于此種測序方法有一定的具局限性，不能夠全面反映出整個(gè)樣品中HAV全部基因組突變概率和真實(shí)變化情況。而第二代高通量測序的基本原理是邊合成邊測序，它能夠一次對幾百萬到幾億條DNA分子進(jìn)行序列測定，具有高通量、超深度、高靈敏度并且速度快、準(zhǔn)確率高、成本低和信息量豐富等優(yōu)點(diǎn)，而且能夠全面地反映基因組上變異圖譜[9-10]。

我所學(xué)者己經(jīng)采用第二代基因測序的方法,對脊髓灰質(zhì)炎病毒進(jìn)行了研究[11]，受此啟發(fā)，本試驗(yàn)對甲肝病毒H2M20K7主代毒種、工作種子、疫苗代次及傳代后不同代次的病毒采用高通量測序(二代基因測序法)方法進(jìn)行病毒的全基因序列測定，從分子水平對H2株不同代次病毒的基因穩(wěn)定性和毒力基因位點(diǎn)變異率進(jìn)行分析，以進(jìn)一步考察H2株毒種在連續(xù)傳代過程中的遺傳穩(wěn)定性和毒力特征, 也為疫苗株的選擇、制備和穩(wěn)定性考察提供參考和借鑒。

1　材料與方法

1.1病毒及細(xì)胞甲肝病毒原始種子H2M20K5(K5)由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，經(jīng)生物所用KMB17細(xì)胞再傳代2次，獲得H2M20K7主代種子批(K7)，批號(hào)為201201。K7再經(jīng)KMB17細(xì)胞連續(xù)傳代三次，建立了工作種子庫H2M20K10(K10)。KMB17細(xì)胞種子來源于生物所二室，是生物所于1972建立的人二倍體細(xì)胞株[12]，也是目前用于生產(chǎn)H2株減毒活疫苗的細(xì)胞，工作細(xì)胞代次為16代,批號(hào)為201501.

1.2主要試劑及儀器MEM培養(yǎng)基購自美國Gibico公司；新生牛血清購自蘭州民海生物；細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞維持液、病毒稀釋液的其他成分均由本所提供；細(xì)胞培養(yǎng)容器為美國nunc細(xì)胞工廠；病毒RNA提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Kit)為德國Qiagen公司提供；大容量高速離心機(jī)購自美國THERMO；超聲破碎儀購自美國 Thermo；洗板機(jī)：美國BioTek ELX50；酶標(biāo)儀:美國BioTek SynergyHT；HAV-Ag檢測板:生物所生物制品九室提供。

1.3病毒連續(xù)傳代及樣品制備參照甲肝病毒生產(chǎn)工藝，取甲肝減毒活疫苗工作種子H2M20K10(K10)，經(jīng)凍融超聲后，接種在培養(yǎng)成單層的KMB17細(xì)胞上(病毒接種MOI為0.1, 細(xì)胞代次為32代)，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程更換維持液，繼續(xù)培養(yǎng)至病毒增值高峰期(22～26 d)收獲病毒，得到疫苗代次病毒(K11)。 按上述方法，通過8個(gè)周期連續(xù)傳代，得到K12～K18不同代次的病毒，凍存于-20 ℃待用。

1.4病毒感染性滴度檢測取不同代次的病毒液(K7,K10,K11,K13,K15,K18)，超聲破碎后作10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度接種5個(gè)小方瓶，然后將小方瓶放入37 ℃恒溫培養(yǎng)2 h取出，加入培養(yǎng)液，放入35 ℃恒溫培養(yǎng)至24 d收獲病毒，然后用ELISA法檢測病毒感染性滴度(lgCCID50/ml)。

1.5病毒基因組RNA提取取不同代次的病毒經(jīng)凍融、超聲破碎后，8 000×g離心1 min，分別取上清150 μl，按QIAamp Viral RNA Kit說明書提取病毒RNA，洗脫得到病毒RNA。

1.6病毒基因組測序?qū)⑻崛〉玫降腞NA，送上海源序生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測序。通過高通量測序技術(shù)(Illumina HiSeqTM2500)得到原始測序序列，對Raw Data進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過序列mapping統(tǒng)計(jì)堿基分布。

1.7基因序列對比分析將二代測序得到的數(shù)據(jù)，以主代毒種K7的全基因序列為基準(zhǔn)，將不同代次的病毒(K10,K11,K13,K15,K18)的全基因組變化情況用PRISM軟件進(jìn)行比較分析， 研究HAV不同代次病毒在5′端非編碼區(qū)、VP1-2 A、2B、2C區(qū)及重要神經(jīng)毒力相關(guān)位點(diǎn)的堿基序列差異及變異情況。

2　結(jié)果

2.1感染性滴度檢測H2株不同代次病毒的感染性滴度維持在7.76～8.50 lgCCID50/ml之間,P值為0.981差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明不同代次病毒在KMB17細(xì)胞中的感染性穩(wěn)定，未發(fā)生較大變化。(見圖1)

圖1　H2株不同代次病毒的感染性滴度Fig.1　Infectious titers of different passages of H2 Virus

圖2　H2株不同代次病毒在5′NCR重要位點(diǎn)的突變率Fig.2　Mutation rate of different passages virus of H2 strain at 5’non coding region

2.2堿基分布可信度分析分析堿基可信度，Q20數(shù)據(jù)可信度在92.94%～97.53%，Q30數(shù)據(jù)可信度在87.87%～94.18%，表明本試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，可作進(jìn)一步的分析。(見表1)

2.3基因突變率及位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)通過smartools找到序列中每個(gè)堿基的覆蓋度，計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的突變率，不同代次病毒在全基因段均有同義突變和非同義突變，但同義突變率均小于4.35%, 非同義突變變異均率小于0.58%(見表2)。

表1　Solexa(二代)測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)堿基分布

表2　不同代次病毒與K7主代毒種相比較的突變率統(tǒng)計(jì)

圖3　H2株不同代次病毒在VP1/2 A，2B，2C，3 A區(qū)突變位點(diǎn)的突變率Fig.3　Mutation rate of different passages virus of H2 strain at VP1/2 A，2B，2C，3 A regions

2.4不同代次病毒在關(guān)鍵基因段及毒力位點(diǎn)的非同義突變情況H2株病毒不同代次的5′NCR非編碼區(qū)基因序列有少量變異，整個(gè)病毒基因的5′ NCR區(qū)的序列相對同源性高、變異很小，最高突變率為：nt124位點(diǎn)0.999%(見圖2)。病毒在連續(xù)傳代后，在VP1/2 A，2B，2C和重要基因位點(diǎn)未發(fā)生明顯突變，基因結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定,最高突變率為：nt4 222位點(diǎn)0.999%(見圖3)。

3　討論

3.1病毒感染性甲型肝炎減毒活疫苗H2株主代毒種K7在KMB17人胚肺二倍體細(xì)胞上經(jīng)連續(xù)傳代至K18，通過對不同代次病毒的感染性滴度進(jìn)行檢測和對比檢測，病毒的感染性滴度維持在7.76～8.50 lgCCID50/ml之間，較為穩(wěn)定，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，H2株主代毒種K7在經(jīng)過KMB17細(xì)胞傳代11次的過程中，不同代次的病毒感染性沒有發(fā)生明顯差異，感染性穩(wěn)定。

3.25′NCR區(qū)基因基因突變率分析結(jié)合Cohen[13-15]、Funkhouser[16]和周德久[17]等進(jìn)行的研究結(jié)果，我們將H2株不同代次病毒的5′ NCR基因序列區(qū)段(nt1～nt750)進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)K7在傳代過程中，不同代次病毒(K10,K11,K13,K15,K18)在整個(gè)5′NCR基因區(qū)段，與K7主代毒株同源性高、變異很小，除特定區(qū)段少數(shù)位點(diǎn)發(fā)生變化之外，大部份的基因未發(fā)生突變，總體突變率<0.1%。這可能是因?yàn)镠2株在主代次毒種以前，經(jīng)長期傳代適應(yīng)了KMB17細(xì)胞株后較為穩(wěn)定，連續(xù)傳代過程中變異率極低。

Schultz[18]的研究中，將HM175野毒株與HM175/P16細(xì)胞適應(yīng)株進(jìn)行對比，認(rèn)為nt 203、204堿基缺失和nt 687位的堿基替換(U687G)是野毒株適應(yīng)細(xì)胞株的特征，這幾個(gè)變化能夠增強(qiáng)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的無帽翻譯過程，增加病毒在細(xì)胞中的適應(yīng)能力。我們將H2株不同代次病毒(K7,K10,K11,K13,K15,K18)的檢測結(jié)果與之相對比，結(jié)果表明在nt 203未發(fā)生缺失，而在nt 204位堿基缺失情況與此前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致，各代次病毒在nt687位點(diǎn)100%為G，為適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)特征。

3.3VP1/2A、2B、2C毒力位特征位點(diǎn)基因突變率分析根據(jù)Emersor等[19-21]研究證明，HAV的毒力基因主要在VP1/2 A、2B、2C區(qū), 毒力相關(guān)基因簇位與細(xì)胞適應(yīng)相關(guān)的核酸位點(diǎn)主要分布在P2區(qū)。其中VP1/2 A連接區(qū)的(nt3 024～3 196)的168個(gè)核苷酸，是目前國際通過的HAV基因分型標(biāo)準(zhǔn)位點(diǎn)。我們將H2株各代次病毒(K10,K11,K13,K15,K18)測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中HM175的減毒株序列對比，在片段V P1/2 A 連接區(qū)nt3024 ～nt3191(168 bp,HM-175)與GenBank 庫中全部HAV序列進(jìn)行核苷酸/氨基酸同源性進(jìn)行分析，結(jié)果證明K7主代毒種及經(jīng)多次傳后的各代次病毒的毒力特征，仍然與M-175/7MK-5 的同源性最高。按照目前國際通用的HAV基因分型標(biāo)準(zhǔn)，基因型屬于IB亞型。與主代K7相比，不同代次病毒在全基因段均有同義突變和非同義突變，但同義突變率小于4.35%，非同義突變率小于0.58%，表明毒株經(jīng)過連續(xù)傳代后，基因變異情況非常小，保持穩(wěn)定的減毒株型別特征。

在HAV病毒毒力位點(diǎn)中，椐Robertson[22]、Paulmann[23]等的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)其中比較關(guān)鍵的位點(diǎn)有：VP1/2 A區(qū)的nt3 025、3 196，2B區(qū)的nt3 889、3 919，2C區(qū)的nt 4 043、4 073、4 087、4 185、4 222、4 563、4 987。我們的研究結(jié)果顯示上述位點(diǎn)突變率為0.0027%～0.675% 之間，變異率極低。本研究中H2株各代次病毒的2C 基因位點(diǎn)nt 4 185(2C/Lys64)與文獻(xiàn)報(bào)道的其他疫苗株一致，并且非常穩(wěn)定，此位點(diǎn)可能參與病毒的減毒[24-25]。檢測結(jié)果與之相同,K18代病毒次在nt3 196、 4 043、4 073、4 222均發(fā)現(xiàn)較前代次基因發(fā)生變異相對較多,突變率在0.006%～0.99%之間,試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明隨著病毒傳代次數(shù)的增加，病毒在多個(gè)基因位點(diǎn)突變率有所增加，但未超過1%。在K10，K11，K13，K15代病毒序列中， nt4 987位點(diǎn)的核苷酸發(fā)生A變?yōu)镚(2C/A4987G)，及2C區(qū)氨基酸由Glu變?yōu)镚ly(2C/Gly331Glu)與劉建生等[26]的研究結(jié)果相同，推測與H2株細(xì)胞基質(zhì)特異的適度減毒特征有關(guān)。

本試驗(yàn)用二代測序的方法對H2株各代次病毒進(jìn)行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)甲肝病毒H2株各代次病毒在KMB17細(xì)胞培養(yǎng)連續(xù)傳代過程中，病毒的遺傳穩(wěn)定性良好，病毒感染性未發(fā)生明顯改變。我們建立的方法和獲得的數(shù)據(jù)，為今后進(jìn)一步研究甲肝疫苗毒株及其他毒株的遺傳穩(wěn)定性打下了基礎(chǔ)，也為研究疫苗的批間一致性提供了新的研究思路。

利益沖突:無

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