豬源P[19]輪狀病毒VP8*蛋白的表達及受體結合特征

王莉鴻　孫曉曼　李丹地　溫紅玲　段招軍

250012 濟南，山東大學公共衛生學院病毒學研究室(王莉鴻、溫紅玲)；102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(孫曉曼、李丹地、段招軍)

急性胃腸炎是導致嬰幼兒死亡的第三大病因，輪狀病毒(rotaviruses, RVs)是該疾病的重要病原體之一[1]。RVs的病毒顆粒由三層蛋白衣殼包裹核心的11段雙鏈RNA構成。結構蛋白VP4和VP7共同構成RVs病毒顆粒衣殼的最外層[2]， VP4蛋白可進一步裂解為VP5*和VP8*兩個蛋白[3]，VP8*蛋白具有識別受體的功能。VP7和VP4還分別是A組RVs血清型G型和P型(genotype)的分型依據[4]，其中G型G1-G4、P型P[4]、P[6]和P[8]型是人群中流行較為廣泛的型別。RV目前分為37個P型，可以進一步分為P[Ⅰ]-P[Ⅴ] 5個基因群(genogroup)[5]， P[Ⅱ]基因群以感染人類為主，P[Ⅲ]和P[Ⅳ]基因群對人和動物均可感染，而P[I]和P[V]基因群主要感染動物。

識別并結合細胞表面的特異性受體對病毒感染至關重要。在RV受體研究中，人們發現部分動物RVs以唾液酸為受體，然而人類和多數動物RVs不識別唾液酸[6]，而以熱休克蛋白70、神經節苷脂以及整合素為潛在受體。近來有研究證明，組織血型抗原(histo-blood group antigens，HBGAs)和黏蛋白核心(mucin core)可以與某些P型VP8*蛋白相互作用，可能是RVs的潛在受體[7-9]。研究不同型別RVs與寡糖的相互作用對于闡明RVs感染機制以及RVs疫苗的研究具有重要意義。

流行病學研究發現某些P型的輪狀病毒具有在人和動物中跨種傳播的潛在可能，因而對動物輪狀病毒的監測也是十分必要的[10-12]。本研究以P[19]型RV為研究對象，P[19]型RV屬于P[Ⅱ]基因群，在人群中散發感染，在豬中比較常見[13-14]。本實驗室在我國豬腹瀉癥狀輪狀病毒監測中，發現了一株豬P[19] 型RV，為闡明豬P[19] 型RV感染和流行機制，對其受體結合特征進行研究，利用蛋白表達技術獲取病毒VP8*蛋白，通過功能實驗研究其與不同類型唾液和寡糖的結合特征，為輪狀病毒感染機制的研究及疾病的監測提供了一定的基礎。

1　材料與方法

1.1材料pGEX4T-1和pET30 a質粒為病毒性腹瀉室保存。感受態DH5α和BL21(DE3)(天根生物公司)；限制性核酸內切酶BamHI、XhoI和T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)；谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B(Glutathione Sepharose 4B)和凝膠層析純化superdex20010/300GL柱子(GE Healthcare公司)；病毒RNA提取試劑盒(中國臺灣Geneaid公司)；異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)(上海Sangon生物公司)；抗谷胱甘肽巰基轉移酶(Glutathione S-Transferase，GST)標簽和辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗小鼠IgG(TransGen公司)。

1.2原核表達質粒pGEX4T-1-P[19]VP8*的構建從豬糞便標本中提取病毒核酸，并逆轉錄為cDNA，以其VP8*(GenBank: KX455847)的編碼序列為模板設計特異性引物，上游引物FBamH1序列為5’-CGCGGATCCGTGTTAGATGGTCC-3’，下游引物RXho1序列為5’-CCGCTCGAGTTATCCAGTGTTAATATATTC-3’，PCR擴增得到VP8*片段(64-223aa)。pGEX4T-1載體和P[19] VP8*片段經限制性核酸內切酶后，T4連接過夜。連接產物轉化DH5α，于LB平板37 ℃過夜培養。挑取單克隆菌落增菌培養，經菌液PCR鑒定陽性者送公司測序，確認成功構建重組質粒，命名為pGEX4T-1-P[19] VP8*。

1.3蛋白預表達重組質粒pGEX4T-1-P[19] VP8*轉化BL21(DE3)感受態，挑取菌落接種LB培養基，37 ℃、170×g搖至OD600約0.6，降溫至20 ℃，使用終濃度為0.4 mmol/L的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)在160×g的轉速下誘導表達16 h，6 000×g離心菌液收集菌體，再用適量的PBS重懸，超聲破碎，留取上清及菌體，凝膠電泳分析蛋白表達情況。

1.4蛋白大量表達和純化經少量LB培養基培養的表達菌按1∶100的比例接種于1.5 L的LB培養基擴大培養，37 ℃搖至OD600至0.6左右，0.4 mmol/L IPTG、20 ℃、160×g誘導表達過夜，6 000×g離心10 min收集菌體，60-80 ml PBS重懸菌體超聲破碎，4 ℃、13 000×g離心1 h后收集上清，即為可溶性帶GST標簽的融合蛋白。上清中加入適量谷胱甘肽瓊脂糖磁珠(Glutathione sepharose 4B)，于翻轉搖床上與融合蛋白室溫結合1 h，30 ml PBS洗beads五次以洗去非特異結合蛋白，再用含10 mmol/L還原性谷胱甘肽、50 mmol/L Tris、 pH=8.0的洗脫液洗脫目的蛋白共計四次，每次15 ml，4℃保存。用20/50溶液(20 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、pH=8.0)平衡凝膠層析純化柱superdex20010/300GL，將親和層析純化后的目的蛋白濃縮至約5 mg/ml，上樣1 ml進行凝膠層析純化，依據UV280的吸收值收集目的蛋白并檢測。

1.5寡糖結合實驗將目的蛋白稀釋成0.2 mg/ml，100 μl/孔包被到96孔酶標板中。4 ℃過夜包被后PBST洗液洗板5次，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。PBST洗板后，將寡糖稀釋為0.002 mg/ml，每孔100 μl，4 ℃過夜結合。2%脫脂奶粉1∶1 000稀釋辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的streptavidin，每孔100 μl加入到PBST洗后的酶標板，37 ℃孵育1 h。顯色試劑顯色后，檢測OD450吸收值。

1.6唾液結合實驗將已測定表型的A、B、AB和O型唾液用PBS按1∶1 000稀釋后過夜包被酶標板。5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。加入VP8*-GST融合蛋白，每孔100 μl，蛋白量達20 μg/孔，4 ℃過夜。鼠抗GST標簽抗體1∶1 000，100 μl/孔，37 ℃孵育1 h。HRP-羊抗鼠1∶10 000，100 μl/孔，37 ℃孵育1 h。其中，每步操作后均用PBST洗液洗板5次并拍干。顯色后， 依據OD450吸收值判斷目的蛋白與唾液的結合情況。

2　結果

2.1重組質粒pGEX4T-1-P[19]VP8*的構建本研究基于腹瀉癥狀的豬糞便樣品中分離的1株P[19]型RV VP8*基因序列設計特異性引物，PCR擴增得到VP8*片段，約480 bp。VP8*片段純化回收后，與質粒pGEX4T-1經BamH I、XhoI雙酶切后T4連接，構建得到pGEX4T-1-P[19] VP8*克隆，轉化DH5α，經菌液PCR鑒定正確者測序，提質粒，進行質粒酶切，酶切得到480 bp條帶，顯示質粒構建成功。

2.2蛋白表達與純化重組質粒轉化BL21(DE3)感受態細胞，IPTG誘導表達，GST標簽親和層析純化后得到可溶性的VP8*-GST融合蛋白，相對分子質量約44 ×103，與預期大小相符。將目的蛋白濃縮后，進行分子篩層析純化以獲取純度更高的蛋白，可見出峰位置大約為14.5 ml處，SDS-PAGE分析此即為VP8*-GST融合蛋白(圖1)，蛋白純度得到進一步的提高。

M：蛋白分子量標準；1：純化后蛋白圖1　P[19] VP8*-GST融合蛋白分子篩層析及SDS-PAGEM, Protein ladder; 1, Purified proteinFig.1　The gel filtration and SDS-PAGE of purified VP8*-GST protein

注：結果為三次平行實驗的均值；A、B、Lea、Leb、Lex、Ley、H1、H2、preⅠ和preⅡ為HBGA；Neu5Ac和Neu5Gc為唾液酸；siaLex為唾液酸化的HBGA；core 2、4、6為黏蛋白核心圖2　P[19] VP8*-GST融合蛋白與不同類型寡糖的結合Note：The result shows the average of three parallel experiments; A, B, Lea, Leb, Lex, Ley, H1, H2, preI and preII are different kinds of HBGA; Neu5Ac and Neu5Gc are different sialic acid; siaLex is sialylated Lex; core2,4,6 are mucin coresFig.2　The oligosaccharides binding assay of P[19] VP8*-GST fusion protein

2.3豬P[19]VP8*-GST融合蛋白結合黏蛋白核心寡糖結合實驗顯示，蛋白與mucin core 2、mucin core 4、mucin core 6都有結合，尤其與mucin core 2具有很好的結合，而與A、B、Lewis型等其他寡糖均無明顯結合(圖2)。

2.4豬P[19]VP8*-GST融合蛋白與唾液結合通過酶免疫分析實驗檢測目的蛋白與各型別唾液樣本的結合特征，陰性對照孔450 nm處的OD吸收值均小于0.1(圖中未顯示)，故將OD450>0.2定為陽性結果，發現P[19] VP8*-GST融合蛋白與A、B、O和O-(非分泌型)型唾液均有結合(圖3)。

注：O-指非分泌型個體；每一欄代表一個唾液樣本；縱坐標指示450 nm處的吸收值；圖3　P[19] VP8*-GST融合蛋白與A、B、O型及非分泌型唾液樣本的結合Note： O- represents the non-secretors; Every column represents one sample； Y-axis shows the absorption at OD450 nm;Fig.3　The binding of P[19] VP8*-GST fusion protein to the A, B, O, and non-secretor type saliva samples

3　討論

P[19]型RV與P[4]、P[6]、P[8]型RV同屬于P[Ⅱ]基因群[5]，P[4]、P[6]、P[8]型RV是人群中廣泛流行的基因型，P[19]型RV以感染動物(豬)為主，同時可以感染人[15]。關于人和豬P[19]型RV感染時有報導，并且流行病學研究發現人和豬P[19]型RV可能存在著重配。2006年在泰國檢測到豬G3P[19] RV毒株，與人RV Mc323和Mc345毒株相近。2009年在印度檢測到比較少見的人G1P[19]輪狀病毒株，進一步提供了人和豬輪狀病毒重組的證據。2011年印度東北部檢測到G4P[4]、G4P[6]、G9P[19]和G10P[6]毒株，通過全基因組分析發現毒株可能來源與豬或者牛RVs，證實了RVs跨種傳播和復雜的基因重排。通過人P[19] RV Mc323和Mc345毒株進行全基因組分析，結果表明該毒株來源于豬P[19] RV，為P[19] RV的來源和跨種傳播提供了依據。綜合基因組測序、進化樹分析等研究表明人和豬P[19] RV可通過基因重排等產生新的毒株，在人和豬中跨種傳播[11-12]。P[19] RV受體結合特征的研究對于揭示RV感染機制及宿主范圍的研究具有重要意義。

據研究報導，P[Ⅱ]組的P[4]、P[6]、P[8]型RVs可以與不同類型的HBGAs和黏蛋白核心相互作用[9]，其中P[6]只與H1型HBGA相結合，而P[4]、P[8]除了與H1型HBGA相互作用外，還可以與Leb和mucin cores 2/4/6結合。而P[Ⅲ]組的P[9]、P[14]、P[25]型RVs則都特異性結合A型抗原。HBGAs是有著豐富多態性的碳水化合物，可分為ABO、分泌型及Lewis三型抗原，在人體的組織、細胞和體液中均存在。黏蛋白是一類大型糖蛋白，可分為膜結合型和分泌型兩類[9]。黏蛋白的寡糖鏈依靠一系列的糖基轉移酶而連接于蛋白骨架上，它們可以與病毒、細菌和粘附分子等結合，發揮信號傳遞的作用。研究表明，RVs與寡糖的相互作用關系可因病毒P基因型的不同而產生差異[7]。

本研究以P[19]型RV為研究對象，選擇輪狀病毒監測中已鑒定的一株豬P[19]型RV，研究P[19]型RV的受體結合特性。通過寡糖結合實驗發現其與黏蛋白核心結合，特別是mucin core 2，而與A、B、lewis等類型HBGAs都不結合。此外，發現豬P[19] VP8*與人A、B、O型以及非分泌型唾液都有一定的結合，更一步表明其在人群中具有潛在感染能力，對P[19]型RV在人以及豬中的流行都應該予以監測。

利益沖突無

[1]Tate JE, Burton AH, Boschi-Pinto C, et al. 2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: a systematic review and meta-analysis [J]. Lancet Infect Dis, 2012, 12 (2): 136-141. DOI:10.1016/S1473-3099(11)70253-5.

[2]Dormitzer PR, Sun ZY, Wagner G, et al. The rhesus rotavirus VP4 sialic acid binding domain has a galectin fold with a novel carbohydrate binding site [J]. EMBO J, 2002, 21 (5): 885-897.DOI:10.1093/emboj/21.5.885.

[3]Padilla-Noriega L, Dunn SJ, Lopez S, et al. Identification of two independent neutralization domains on the VP4 trypsin cleavage products VP5*and VP8*of human rotavirus ST3 [J]. Virology, 1995, 206 (1): 148-154.DOI:110.1016/s0042-6822(1095)80029-80028.

[4]Trojnar E, Sachsenr?der J, Twardziok S, et al. Identification of an avian group A rotavirus containing a novel VP4 gene with a close relationship to those of mammalian rotaviruses [J]. J Gen Virol, 2013, 94 (Pt 1): 136-142.DOI:10.1099/vir.0.047381-0.

[5]Liu Y, Huang P, Tan M, et al. Rotavirus VP8*: Phylogeny, host range, and interaction with histo-blood group antigens [J]. J Virol, 2012, 86 (18): 9899-9910.DOI:10.1128/JVI.00979-12.

[6]Ciarlet M, Estes MK. Human and most animal rotavirus strains do not require the presence of sialic acid on the cell surface for efficient infectivity [J]. J Gen Virol, 1999, 80(Pt 4):943-948.DOI:10.1099/0022-1317-80-4-943.

[7]Huang P, Xia M, Tan M, et al. Spike protein VP8*of human rotavirus recognizes histo-blood group antigens in A type-specific manner [J]. J Virol, 2012, 86 (9): 4833-4843.DOI:10.1128/JVI.05507-11.

[8]Hu L, Crawford SE, Czako R, et al. Cell attachment protein VP8*of a human rotavirus specifically interacts with a-type histo-blood group antigen [J]. Nature, 2012, 485 (7397): 256-259.DOI: 10.1038/nature10996.

[9]Liu Y, Ramelot TA, Huang P, et al. Glycan specificity of p[19] rotavirus and comparison with those of related p genotypes [J]. J Virol, 2016, 90 (21): 9983-9996.DOI:10.1128/JVI.01494-16.

[10]Mukherjee A, Ghosh S, Bagchi P, et al. Full genomic analyses of human rotavirus G4P[4], G4P[6], G9P[19] and G10P[6] strains from North-eastern India: evidence for interspecies transmission and complex reassortment events [J]. Clin Microbiol Infect, 2011, 17 (9): 1343-1346.DOI: 10.1111/j.1469-0691.2010.03383.x.

[11]Ghosh S, Urushibara N, Taniguchi K, et al. Whole genomic analysis reveals the porcine origin of human G9P[19] rotavirus strains Mc323 and Mc345 [J]. Infect Genet Evol, 2012, 12 (2): 471-477.DOI: 10.1016/j.meegid.2011.12.012.

[12]Maneekarn N, Khamrin P, Chan-it W, et al. Detection of rare G3P[19] porcine rotavirus strains in Chiang Mai, Thailand, provides evidence for origin of the VP4 genes of Mc323 and Mc345 human rotaviruses [J]. J Clin Microbiol, 2006, 44 (11): 4113-4119.DOI:10.1128/JCM.00954-06.

[13]Ianiro G, Delogu R, Graffeo R, et al. Detection of rare G3P[19] group A rotavirus in human patient, Italy [J]. Emerg Infect Dis, 2014, 20 (11): 1906-1910.DOI: 10.3201/2011.131699.

[14]My PV, Rabaa MA, Donato C, et al. Novel porcine-like human G26P[19] rotavirus identified in hospitalized paediatric diarrhoea patients in Ho Chi Minh City, Vietnam [J]. J Gen Virol, 2014, 95 (Pt 12): 2727-2733.DOI:10.1099/vir.0.068403-0.

[15]李靜,官旭華,張婷，等. 2013-2014年湖北省哨點醫院A組輪狀病毒G和P基因型遺傳變異分析[J].中華預防醫學雜志,2017,51(1):93-95.DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.01.018.