指紋圖譜技術結合指標成分測定法監控顆粒劑制備

楊曉瑩,竇桃艷,潘成成,呂延英,陳園園,賀懷貞,盧　聞

(1.西安交通大學 醫學部， 陜西 西安　710061;2.西安世紀盛康藥業有限公司, 陜西 西安　710300)

中藥色譜指紋圖譜技術是一種有效、常用的中藥制劑質量研究技術[1-2],目前主要用于評價中藥材及中藥制劑質量的真實性、優良性和穩定性等方面。近年來,中藥指紋圖譜技術也廣泛應用于中藥制劑制備工藝的控制和評價[3-4],通過對制備過程中各中間體的指標成分定性、定量分析從而呈現出物質群在整個工藝過程中的變化情況,是一種可行的中藥生產過程質量控制模式[5]。腎康注射液是目前臨床應用廣泛、治療慢性腎衰竭的中藥注射劑[6],為擴大產品品種,適應市場需求,研制了腎康顆粒。本研究選取腎康顆粒中的有效成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、丹酚酸B、羥基紅花黃色素A(HYSA)和毛蕊異黃酮葡萄糖苷等8個成分作為主要指標成分[7],通過指紋圖譜技術對物質群的定性分析和指標成分在腎康顆粒制備工藝過程中各中間體中含量的變化,建立制備工藝過程控制的方法[8]。這種采用指紋圖譜技術與多指標成分定量相結合的綜合評價方法可以有效地評價制劑制備工藝的合理性,同時控制從原藥材到制劑的質量,為中藥制劑生產的過程控制和保障藥效發揮提供基礎保障[9-10]。

1　儀器和試劑

1.1　儀　器

高效液相色譜儀(LC-2010 HT,SHIMADZU,Japan);DAD(SPD-M20A);控制器(SBM-20A);LC Solution 色譜工作站(島津國際貿易有限公司);真空干燥箱(DAF-6020,鞏義市英峪予華儀器廠);旋轉蒸發器(RE-52A,上海亞榮生化儀器廠)。

1.2　試　藥

蘆薈大黃素(批號 110795-201308)，大黃酸(批號 110757-200206)，大黃素(批號 110756-200110)，大黃酚(批號 110796-201319)，大黃素甲醚(批號 110758-201415)，HYSA(批號 111637-201308)，丹酚酸B(批號 111562-201313)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號 110756-200110)均購自中國食品藥品檢定研究院;單味藥材、腎康顆粒中間體(水煎液、醇沉液、水沉液)和腎康顆粒均由西安世紀盛康藥業有限公司提供;乙腈、甲酸均為色譜純,其余試劑均為分析純(天津市科密歐化學試劑有限公司)。

2　方　法

2.1　溶液的制備

2.1.1混合標準溶液的制備精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、HYSA、丹酚酸B、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品于量瓶中,加甲醇溶解、稀釋并定容至刻度,制成濃度分別為72.0，112.0，106.0，10.7，29.4，9.9，11.6，41.2 μg/mL的混合標準溶液。

2.1.2藥材供試品溶液的制備腎康顆粒中四味藥材大黃、丹參、紅花和黃芪的供試品溶液制備方法參照《中華人民共和國藥典2015年版》中藥材項下含量測定的樣品制備方法[11]。

2.1.3腎康顆粒各中間體和腎康顆粒供試品溶液的制備腎康顆粒劑中間體包括水煎液、醇沉液、水沉液,其中水煎液和醇沉液分為A組和B組。A組為大黃和丹參合煎液,B組為黃芪和紅花合煎液;將A，B兩組水煎液分別經過醇沉處理分別得到A，B組醇沉液;水沉液是合并兩組醇沉液進行水沉處理;根據各中間體的得率,按處方藥味組成折算水煎液、醇沉液、水沉液和顆粒的取樣量,其供試品溶液的制備方法如下。

精密稱取A組水煎液樣品約1.80 g,醇沉液樣品約0.59 g;B組水煎液樣品約2.34 g,醇沉液樣品約0.71 g;水沉浸膏約1.24 g;腎康顆粒約4.70 g,分別精密加入70%甲醇30 mL,稱定重量,浸泡1 h,超聲提取20 min(功率200 W,頻率40 kHz),放冷,再稱定重量,用70%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過。精密量取續濾液20 mL,揮去溶劑,殘渣加甲醇適量使溶解,轉移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得水煎液、醇沉液、水沉液以及腎康顆粒供試品溶液。

2.2　腎康顆粒HPLC-DAD色譜條件的建立

以Welchrom-C18液相色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)為固定相;乙腈(A)和0.1%甲酸溶液(B)為流動相梯度洗脫,洗脫程序如表1所示;進樣量:10 μL;檢測波長為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚和毛蕊異黃酮葡萄糖苷均為254 nm,丹酚酸B為288 nm,HYSA為403 nm。

表1　梯度洗脫程序Tab.1　Gradient elution program

2.3　定性分析

將藥材供試品溶液、腎康顆粒各中間體供試品溶液、腎康顆粒劑供試品溶液分別進高效液相色譜儀分析,記錄各檢測波長下的色譜圖。根據制備工藝,將大黃和丹參藥材、A組各中間體及顆粒的HPLC-DAD指紋圖譜在254 nm和288 nm下進行多波長融合,將紅花和黃芪藥材、B組各中間體及顆粒的指紋圖譜在254 nm和403 nm下進行多波長融合,導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版,以藥材的融合指紋圖譜作為參照圖譜,中位數法生成對照指紋圖譜(圖譜中標記為R),計算各指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度,并對共有峰進行匹配和定性分析。

2.4　定量分析

將腎康顆粒各中間體供試品溶液進高效液相色譜儀分析,計算相當于1 g處方生藥的各中間體中8個指標成分的含量。

3　結　果

3.1　混合對照品溶液的HPLC-DAD融合色譜圖

將混合對照品溶液的HPLC-DAD色譜圖在254 nm，288 nm和403 nm下進行多波長融合,得到可以同時顯示8個指標成分的對照品溶液的融合色譜圖，如圖1所示。

1 HYSA；2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷；3 丹酚酸B; 4 蘆薈大黃素;5 大黃酸;6 大黃素;7 大黃酚;8 大黃素甲醚圖1　混合對照品溶液的HPLC-DAD指紋圖譜Fig.1　HPLC-DAD fingerprint of mixed reference solution

3.2　指紋圖譜定性分析結果

3.2.1大黃和丹參的融合指紋圖譜分析大黃和丹參藥材的融合指紋圖譜與各中間體的融合指紋圖譜共匹配得到21個共有峰(圖2),可作為腎康顆粒制備過程中對大黃、丹參物質組成監測的定性指標。通過與混合對照品溶液的融合色譜圖對比確定峰12,15,17,18,19,21分別為丹酚酸B、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚。表2為腎康顆粒各中間體指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度計算結果,水煎液、醇沉液、水沉液、顆粒與藥材的相似度值從0.88遞減到0.76,隨著處理步驟的增加,各中間體和顆粒與藥材的相似度降低;醇沉液、水沉液和顆粒與水煎液的相似度值均高于0.90,表明后續的工藝最大化的保持了水煎液中大黃、丹參的物質組成。

3.2.2黃芪和紅花的融合指紋圖譜分析圖3為紅花和黃芪藥材的融合指紋圖譜和各中間體的融合指紋圖譜疊加圖,共匹配得到27個共有峰,可作為腎康顆粒制備過程中對黃芪、紅花物質組成監測的定性指標。與混合對照品溶液的融合色譜圖比對確定峰1為HYSA,峰3為毛蕊異黃酮葡萄糖苷;藥材及各中間體的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度計算結果見表3,藥材與各中間體相似度較高,與顆粒相似度接近0.80,各中間體與顆粒的相似度均大于0.90,表明共有峰能夠反映腎康顆粒各工藝所得中間體和成品的黃芪、紅花藥味的物質組成。

3.3　定量分析結果

相當于處方生藥1 g的水煎液、醇沉液、水沉液和顆粒中的各指標成分的含量計算結果見表4,可知,丹酚酸B和毛蕊異黃酮葡萄糖苷經醇沉過程后,含量略有降低;大黃素經水沉工藝后,含量降低;而水沉液和顆粒中指標成分的含量差別較小,8個指標成分能夠反映腎康顆粒處方藥味經不同工藝處理后,代表性成分的含量變化,可用于監測各中間體的質量變化情況。

S1 藥材;S2 A組水煎液；S3 A組醇沉液；S4 水沉液；S5 顆粒12 丹酚酸B；15 蘆薈大黃素；17 大黃酸；18 大黃素；19 大黃酚；21 大黃素甲醚圖2　大黃和丹參藥材及腎康顆粒各中間體的HPLC-DAD融合指紋圖譜疊加圖Fig.2　HPLC-DAD multi-wavelength fusion fingerprints of rhubarb, salviaemiltiorrhizae and intermediates of Shenkang granules

Tab.2The similarity between the fusion fingerprints and the control fingerprints of rhubarb, radix salviaemiltiorrhizae and intermediates of Shenkang granules

藥材水煎醇沉水沉顆粒對照指紋藥材1水煎08831醇沉084009761水沉0763091809731顆粒07550897093609751對照指紋082909120945095309891

S1 藥材；S2 B組水煎液；S3 B組醇沉液；S4 水沉液；S5 顆粒1 HYSA；3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷圖3　紅花和黃芪藥材及腎康顆粒各中間體的HPLC-DAD融合指紋圖譜疊加圖Fig.3　HPLC-DAD multi-wavelength fusion fingerprints of radix astragali, safflower and intermediates of Shenkang granules

Tab.3The similarity between the fusion fingerprints and the control fingerprints of safflower, radix astragaliandintermediates of Shenkang granules

藥材水煎醇沉水沉顆粒對照指紋藥材1水煎08321醇沉082909661水沉0805093109501顆粒07800905093509941對照指紋081309080925097509821

表4　腎康顆粒制備中間體中的指標成分含量(n=3,×10-2 mg/g)Tab.4　The content of index components in the intermediates of Shenkang granules(n=3，×10-2 mg/g)

4　討　論

本研究采用中藥指紋圖譜技術結合指標成分定量方法,旨在建立能監測腎康顆粒制備過程的質控方法。通過將同一樣品不同波長的指紋圖譜進行融合從而得到可同時體現3個波長、8個指標成分信息的腎康顆粒劑各中間體的指紋圖譜,全面直觀地反映制備過程中有效物質群在各中間體中的變化,避免采用單一波長單一指標成分評價制劑制備過程而導致的代表性不足;同時結合指標成分定量法測定8個指標成分在各中間體中的含量,這種定性定量分析相結合的研究方法可以系統地監控腎康顆粒劑的制備過程,便于有效地控制從原藥材到制劑制備過程中的質量,同時利于優化制備工藝[12],可作為中藥制劑生產過程的質量控制方法。

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