高血糖對(duì)骨髓干細(xì)胞衰老的影響＊

劉畇 ，朱艷 ，盛霞 ，何琪 ，魏宏 ，簡(jiǎn)蔚泓 ，寧紅紅 ，秦淑蘭

(1、蚌埠醫(yī)學(xué)院，蚌埠 233030；2、南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院，南昌 330008)

骨髓干細(xì)胞在特定的機(jī)體環(huán)境下能分化發(fā)展成血管內(nèi)皮細(xì)胞，并可分泌血管生長(zhǎng)因子，參與組織損傷的修復(fù)和血管的再生；另外骨髓干細(xì)胞采集方便、取自自身，因此沒(méi)有排斥反應(yīng)，也避免了倫理學(xué)糾紛而具有特殊的優(yōu)勢(shì)[1-3]。糖尿病是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病，是我國(guó)常見(jiàn)病、多發(fā)病，與非糖尿病人群相比較，其缺血性疾病患病率極高且發(fā)病年齡輕、病情進(jìn)展快[4，5]。目前，骨髓干細(xì)胞在糖尿病患者中治療性血管新生的研究得到了廣泛的開(kāi)展，然而大部分研究結(jié)果顯示該項(xiàng)治療在合并有糖尿病狀態(tài)下療效欠佳，并認(rèn)為與高血糖毒性有必然的聯(lián)系[6，7]。我們認(rèn)為高血糖可促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的衰老加速，從而導(dǎo)致該項(xiàng)治療療效降低，然而目前相關(guān)研究甚少。因此，我們對(duì)高血糖狀態(tài)下骨髓干細(xì)胞衰老是否加速進(jìn)行了探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料6-8周齡雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量（20.5±1.34）g，均在無(wú)病理?xiàng)l件下自由進(jìn)食進(jìn)水。鏈脲佐 菌 素（STZ）、DAPI 購(gòu) 自 Sigma 公 司 ；FITC-conjugatedratanti-mouseCD117(c-Kit)monoclonal antibody購(gòu)自美國(guó) BD Pharmingen公司；anti-FITC microbeads購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotech公司，抗γ-H2AX抗體 (Polyclonal Rabbit anti-γ-H2AX購(gòu)自abcam公司（美國(guó)）；抗P16INK4a抗體(Polyclonal Rabbit anti-P16INK4a)購(gòu)自Santa Cruz公司（美國(guó))；抗 β-actin抗體(Polyclonal rabbit antiβ-actin)購(gòu)自 Cell Signaling 公司（美國(guó)）；二抗 Goat anti-Rabbit IgG-HRP購(gòu)自KPL公司（美國(guó)）；強(qiáng)生血糖儀（美國(guó)）；MiniMACS Separator(德國(guó))；NIKON倒置熒光顯微鏡（日本）；蛋白電泳儀（美國(guó)），垂直電泳槽（美國(guó)）；轉(zhuǎn)移電泳槽（美國(guó)）；精密電子天平(德國(guó))；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)）。

1.2方法

1.2.1STZ糖尿病小鼠模型的制備及分組 6-8周齡的 BALB/c雄性小鼠腹腔注射 STZ（60mg/kg，pH4.4，無(wú)菌檸檬酸緩沖液稀釋，每天腹腔注射1次，連續(xù)5d），注射結(jié)束后第3d測(cè)隨機(jī)血糖，高于15mmol/L認(rèn)為糖尿病模型制備成功。正常對(duì)照組：6-8周齡的BALB/c雄性小鼠腹腔注射無(wú)菌檸檬酸緩沖液稀釋，每天腹腔注射1次，連續(xù)5d。制模成功8周后，用于以下實(shí)驗(yàn)分組。

1.2.2骨髓CD117+干細(xì)胞的分離分別測(cè)量?jī)山M的體質(zhì)量及血糖后，將小鼠麻醉，腹主動(dòng)脈脫血后，在無(wú)菌的條件下取股骨及脛骨，用phosphatebuffered saline（PBS）沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液，使用比重離心液去除紅細(xì)胞后，使用免疫磁珠分離法（MACS）分離出 CD117+細(xì)胞。

1.2.3共聚焦檢測(cè)骨髓干細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)將MACS分離得到的CD117+細(xì)胞，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞的濃度為 1×105個(gè)/ml，按照試劑盒(Cell Biolabs，DNA Double Strand Break Assay)步驟標(biāo)準(zhǔn)操作，具體如下：接種在多聚賴氨酸包被的24孔培養(yǎng)板上，每孔接種1ml。體外培養(yǎng)12h之后，使用PBS清洗3次后，接著細(xì)胞用多聚甲醛固定，加入抗小鼠γ-H2AX抗體室溫下反應(yīng) 1h，PBS清洗 3次后與FITC標(biāo)識(shí)的二抗反應(yīng)，之后再用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4Western blot檢測(cè)γ-H2AX以及p16蛋白表達(dá) 取MACS分離得到的CD117+細(xì)胞，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞的濃度為1×106-107個(gè)/ml，提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western blot分析，檢測(cè)γ-H2AX蛋白表達(dá)以及衰老相關(guān)蛋白p16表達(dá)的變化，內(nèi)參β-actin蛋白的含量作為參照計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)。 P≤0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2　結(jié)果

2.1兩組體重及血糖情況造模前兩組小鼠體重[正常對(duì)照組（19.91±0.84）g，糖尿病組（20.21±0.97）g]；血糖[正常對(duì)照組（7.68±0.67）mmol/L，糖尿病組（7.60±0.92）mmol/L]，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模成功8周后，正常對(duì)照組及糖尿病組體重分別為（28.14±0.83）g、（21.13±0.79）g，血糖分別為（7.85±0.66）mmol/L、（21.28±1.46）mmol/L， 糖尿病組與正常對(duì)照組相比多飲、多尿癥狀較重，體重明顯低下(P＜0.001)，糖尿病組血糖水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.001)。

2.2高血糖對(duì)骨髓干細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)量的影響通過(guò)熒光共聚焦顯微鏡觀察兩組骨髓干細(xì)胞DSB標(biāo)志物γ-H2AX（綠色熒光）表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，糖尿病組骨髓干細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)更為明顯，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.0006，n=3）。 （見(jiàn)圖 1）

圖1　A：熒光共聚焦顯微鏡下觀察高血糖對(duì)骨髓干細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)量的影響（10倍分辨率，細(xì)胞核顯示藍(lán)色熒光，γ-H2AX顯示綠色熒光）B：兩組骨髓干細(xì)胞熒光染色后，γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞百分比定量結(jié)果（STZ：糖尿病組；WT：對(duì)照組）；*P＜0.001

2.3高血糖對(duì)骨髓干細(xì)胞γ-H2AX以及p16蛋白表達(dá)的影響通過(guò)Western blot分析兩組骨髓干細(xì)胞DSB標(biāo)志物γ-H2AX以及衰老相關(guān)蛋白p16蛋白表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比、糖尿病組骨髓干細(xì)胞γ-H2AX以及p16蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。（見(jiàn)圖2）

3　討論

圖2　Western blot檢測(cè)高血糖對(duì)骨髓干細(xì)胞γ-H2AX以及p16蛋白表達(dá)的影響

缺血性疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，傳統(tǒng)療法主要為藥物緩解和手術(shù)再通，但對(duì)于嚴(yán)重缺血性疾病療效欠佳[8，9]。近年來(lái)，骨髓干細(xì)胞移植治療重癥缺血性疾病作為一種新療法成為關(guān)注的焦點(diǎn)[1-3]。骨髓干細(xì)胞是一種具有高度自我更新、強(qiáng)分化潛能及多重分化活性的細(xì)胞[10，11]，其細(xì)胞標(biāo)志物包括CD117及 CD34[12，13]。眾多國(guó)內(nèi)外研究表明，移植到缺血區(qū)的骨髓干細(xì)胞，可通過(guò)歸巢、聚集并融入缺血組織附近，分化發(fā)展成血管內(nèi)皮細(xì)胞及分泌血管生長(zhǎng)因子，移植細(xì)胞的存活率與治療效果密切相關(guān)[14，15]。

糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，糖尿病患者合并缺血性疾病的發(fā)病率增高，常規(guī)藥物及手術(shù)治療效果欠理想[16]。近年來(lái)，自體骨髓干細(xì)胞移植治療得到一定的應(yīng)用，但不少研究結(jié)果表明其療效欠佳，Govaert等的研究及Jiménez-Quevedo等的研究[17，18]均證實(shí)糖尿病合并缺血性心臟病患者給予骨髓干細(xì)胞移植后，心臟功能無(wú)改善，然而療效欠佳的原因至今未明。

眾所周知，細(xì)胞衰老是指可增殖細(xì)胞在信號(hào)通路的調(diào)控下，不可逆地脫離細(xì)胞周期后進(jìn)入的一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，細(xì)胞衰老涉及DNA的損傷與修復(fù)、線粒體的能量代謝以及一系列基因的調(diào)控等[19]。高血糖可引起機(jī)體氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的衰老[20，21]。因此本研究通過(guò)建立STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型，探討了高血糖狀態(tài)是否促進(jìn)CD117+骨髓干細(xì)胞DNA受損、從而加速細(xì)胞衰老。本研究考慮到高血糖狀態(tài)的長(zhǎng)期影響效果，我們?cè)谔悄虿∧Ｐ徒３晒?周后，才收集了骨髓干細(xì)胞進(jìn)行分析。我們發(fā)現(xiàn)糖尿病組與正常對(duì)照組相比，DNA雙鏈斷裂(DSB)損傷標(biāo)志物γ-H2AX表達(dá)明顯增強(qiáng)。我們進(jìn)一步采用Western blot檢測(cè)γ-H2AX以及衰老相關(guān)蛋白p16表達(dá)情況，結(jié)果也提示與正常對(duì)照組相比，糖尿病組骨髓干細(xì)胞γ-H2AX以及p16蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)。以上結(jié)果表明高血糖狀態(tài)可促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的衰老。眾多研究表明高血糖引起的氧化應(yīng)激可破壞DNA的結(jié)構(gòu)而引發(fā)DNA損傷應(yīng)答、或者直接調(diào)控衰老相關(guān)的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞衰老的發(fā)生[22]。

該研究首次分析了高血糖狀態(tài)對(duì)骨髓干細(xì)胞衰老的影響，具有一定的新意，但也存在一定的不足點(diǎn)：首先，未能在機(jī)制上進(jìn)一步論證所得結(jié)果；其次，本研究所得的結(jié)果是體外分析結(jié)果，而機(jī)體體內(nèi)微環(huán)境遠(yuǎn)遠(yuǎn)比體外復(fù)雜。以上不足有待今后的研究中去解決，包括給予糖尿病小鼠抗氧化應(yīng)激治療后分析骨髓干細(xì)胞衰老狀況。

綜上所述，我們證實(shí)了高血糖狀態(tài)可促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的衰老，為骨髓干細(xì)胞移植在糖尿病合并缺血性疾病患者方面的應(yīng)用提供了一定基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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