實驗獼猴B病毒抗體檢測結果分析

獼猴別名恒河猴、老青猴、廣西猴等，主要分布在我國廣東、廣西、云南、貴州等地，獼猴對自然環境的適應性很強，且易于馴養繁殖。因獼猴在生理上與人類較接近，故是生命科學研究，尤其是老年醫學、神經醫學和生理學、心理學等應用較多的非人靈長類實驗動物之一。B病毒又稱猴皰疹病毒1型，獼猴感染B病毒后就像人類感染皰疹病毒一樣，一般只引起局部或者無癥狀的感染，且能在1～2周內自愈。但人類感染B病毒后果較嚴重，可能會導致腦炎、腦脊髓膜炎，病情嚴重可出現呼吸麻痹乃至死亡[1-4]。因此，實驗動物微生物等級及監測(GB14922.2-2001)要求普通級獼猴必須排除B病毒[5]。本研究使用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)與免疫酶試驗對采集實驗獼猴血清樣本進行B病毒抗體檢測，分析實驗獼猴B病毒抗體陽性情況，現報道如下。

1　對象與方法

1.1實驗對象選取安徽省實驗獼猴中心獼猴400只，雌性獼猴215只(53.75%)，雄性獼猴185只(46.25%)，年齡1～15歲，平均(4.35±2.56)歲，體質量2～12 kg，平均(4.08±1.52)kg。每只獼猴均采集靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，吸取血清至2 mL EP管，放置在-30℃冰箱中備用。

1.2檢測試劑與方法B病毒抗原片及試劑由北京市實驗動物研究所提供，獼猴B病毒ELISA檢測試劑盒由廈門慧嘉生物科技有限公司提供。按照GB/T 14926.60-2001 實驗動物獼猴皰疹病毒I型(B病毒)檢測方法、GB/T 14926.50-2001 實驗動物酶聯免疫吸附試驗及GB/T 14926.51-2001 實驗動物免疫酶試驗規定[6-8]，使用ELISA和免疫酶試驗檢測，嚴格按照試劑說明書要求進行。

1.3結果判定免疫酶試驗結果判定標準：正?？乖毎麩o色，滴加陽性血清的病毒抗原孔細胞有顏色反應即可判定結果。待檢血清的病毒抗原孔細胞無色判為陰性，呈淺棕色或棕色判為陽性。ELISA方法結果判定標準：陽性對照孔平均值≥1.00，陰性對照孔平均值≤0.10，試驗有效。臨界值=陰性對照孔平均值+0.15，樣品光密度(optical density, OD)值<臨界值，為B病毒抗體陰性；樣品OD值≥臨界值，為B病毒抗體陽性。本研究結果判定標準：ELISA與免疫酶試驗結果均為陽性的樣本為陽性，否則為陰性。

2　結果

2.1檢測結果免疫酶試驗檢測B病毒抗體陽性146份、陰性254份，ELISA檢測B病毒抗體陽性147份、陰性253份。免疫酶試驗檢測B病毒抗體陽性率為36.50%，ELISA檢測結果B病毒抗體陽性率為36.75%，差異無統計學意義(P=1.000)；Kappa檢驗結果顯示，兩種檢測方法一致性良好(Kappa=0.995，P=0.005)。本研究結果判定標準果顯示，B病毒抗體陽性獼猴146只，陰性254只，B病毒抗體陽性率為36.50%。見表1。

表1兩種檢測方法結果比較(只)

免疫酶試驗ELISA陽性陰性合計陽性1460146陰性1253254合計147253400

2.2不同性別實驗獼猴B病毒抗體陽性率比較雌性獼猴B病毒抗體陽性率為36.74%，雄性獼猴則為36.22%，差異無統計學意義(χ2=0.012,P=0.913)。見表2。

2.3不同年齡實驗獼猴B病毒抗體陽性率比較幼年獼猴(0～2歲)B病毒抗體陽性率30.68%，青年獼猴(3～5歲)B病毒抗體陽性率32.34%，成年獼猴(6～15歲)B病毒抗體陽性率66.67%，差異有統計學意義(χ2=26.200,P=0.000)。見表2。

2.4不同體質量獼猴B病毒抗體陽性率比較低體質量獼猴(0～<5 kg)B病毒抗體陽性率為30.30%，正常體質量獼猴(5～<10 kg)B病毒抗體陽性率分別為65.15%，超體質量獼猴(10～12 kg)B病毒抗體陽性率分別為75.00%，差異有統計學意義(χ2=31.402,P=0.000)。見表2。

表2不同性別、年齡和體質量獼猴B病毒抗體陽性結果比較

指標只數檢測結果(只)陽性陰性陽性率(%)χ2值P值性別00120913　雌性215791363674　雄性185671183622年齡262000000　幼年176541223068　青年167541133234　成年5738196667體質量314020000　低體質量3301002303030　正常體質量6643236515　超體質量4317500

3　討論

B病毒是以獼猴為自然宿主的病毒中唯一一個可以感染人類的人獸共患病毒，感染B病毒的獼猴可以通過親密接觸、抓咬和性交等方式將B病毒傳播給自己的同伴。當獼猴自身免疫力低下時，B病毒就有可能引起較嚴重的癥狀。B病毒感染是獼猴飼養及科研工作最危險的職業暴露，人感染B病毒的后果更為嚴重，致死率較高[9]。因此，使用獼猴做實驗動物要求B病毒抗體必須陰性。

B病毒抗體陽性代表獼猴已經感染或者曾經感過B病毒，因此，通過檢測B病毒抗體能反應獼猴B病毒的感染情況。該群獼猴B病毒抗體陽性率為36.50%，介于李晉文等[10]報道的32.6%～37.8%之間，處于較高水平。本研究發現，雌性獼猴B病毒抗體陽性率高于雄性獼猴，但差異無統計學意義(P>0.05)。B病毒抗體陽性率在幼年、青年、成年獼猴中差異有統計學意義(P<0.05)，究其原因可能是：①成年獼猴年齡較長，部分成年獼猴是當年從野外抓獲后馴養的，本身B病毒攜帶率較高，而幼年獼猴多是該中心自行繁殖的，出生后與攜帶B病毒的獼猴進行了隔離，同時通過分欄等方式減少相互抓咬的機會，因此B病毒攜帶率較低；②幼年獼猴尚未成熟，性情較青年獼猴和成年獼猴溫順，發生抓咬的概率較青年、成年獼猴小，同時發生性行為的比例很小，減少了B病毒的傳播。

本研究采用的免疫酶試驗和ELISA方法是比較成熟的免疫學方法，靈敏度較好，特異性良好[11]。但是2種檢測方法也存在一定的缺點，免疫酶試驗方法是通過細胞的變化來判定是否感染B病毒，對觀察者的實驗經驗要求較高，結果判定時需要有經驗的試驗人員對試驗結果進行復核。ELISA檢測方法結果判定簡單，且對實驗者要求不高，但國產的B病毒ELISA檢測試劑盒質量參差不齊，購買時需選擇認可度較高的產品。同時，2種檢測方法都要嚴格按照說明書要求進行實驗，陽性對照和陰性對照均符合才能判定結果，否則需重新實驗。

為減少B病毒在實驗獼猴中的傳播，獲得更多合格的實驗獼猴，建議采取以下措施：①保持飼養場地的清潔、衛生，工作人員進入飼養場地佩戴口罩、帽子、手套等防護裝備；②設置遠離健康猴群飼養區的獨立隔離飼養區，對新進的獼猴進行B病毒抗體檢測，檢疫合格的獼猴方可進入健康飼養區；③加強獼猴的管理，獼猴按照性別、年齡等合理分籠飼養，減少獼猴之間相互抓咬、攻擊等活動。

[1]ENGEL G A, JONES-ENGEL L, SCHILLACI M A, et al. Human esposure to herpesvirus B-seropositive macaques, Bali, Indonesia[J]. Emerg infect Dis, 2002, 8(8):789-795.

[2]HUSS J L, BARRY P A. B-virus(cercopithecine herpesvirus 1)infection in humans and macaques:potential for zoonotic disease[J]. Emerg Infect Dis, 2003, 9(2):246-250.

[3]LEE M L, ROSTAL M K, HUGHES T, et al. Macacine herpesvirus 1 in long-tailed macaques, Malaysia, 2009-2011[J].Emerg Infect Dis,2015,21(7):1107-1113.

[4]ELMORE D, EBERL R. Monkey B Virus(cercopithecine herpesvirus 1)[J]. Comp Med, 2008, 58(1):11-21.

[5]GB14922.2-2001 實驗動物 微生物等級及監測[s].北京：中國標準出版社，2001.

[6]GB/T 14926.60-2001 實驗動物 獼猴皰疹病毒I型(B病毒)檢測方法[s].北京：中國標準出版社，2001.

[7]GB/T 14926.50-2001 實驗動物 酶聯免疫吸附試驗試驗[s].北京：中國標準出版社，2001.

[8]GB/T 14926.51-2001 實驗動物 免疫酶試驗[s].北京：中國標準出版社，2001.

[9]楊燕飛，周潔，高誠. 猴B病毒研究進展[J].動物醫學進展，2015, 36(7):94-99.

[10]李晉文，佟巍，蔡娟，等.廣東地區實驗恒河猴B病毒感染情況的調查[J].中國比較醫學雜志，2017, 27(7):13-15.

[11]王計平, 鄔繼文, 呂龍寶. 獼猴B病毒抗體的檢測報告[J]. 中國獸醫雜志, 2014, 50(2):81-82.