蜈蚣草快繁及其組培苗對(duì)砷的富集研究

王玲仙, 曾 民, 陳 玲, 付 堅(jiān), 柯 學(xué), 王 波, 陳 越, 程在全

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650223)

【研究意義】蜈蚣草(PterisvittataLinn.)屬于鳳尾蕨科Pteridaceae、鳳尾蕨屬Pteris，蜈蚣草又名長葉甘草蕨，廣布中國江南各省，北至陜甘及河南南部也有分布，主要生于鈣質(zhì)土和石灰?guī)r上，并具有較高的觀賞、藥用和環(huán)保價(jià)值[1-2]。在觀賞價(jià)值方面，由于其羽葉優(yōu)美，栽培較為廣泛，并且常用于配置山石盆景；在藥用價(jià)值方面，據(jù)植物志記載，藥用可祛風(fēng)除濕、殺蟲、治疳瘡、止血、止瀉等功效[3-6]；在環(huán)保價(jià)值方面，隨著工業(yè)和城市化建設(shè)發(fā)展造成包括汞(Hg)、鎘(Cd)、鉛(Pb)、鉻(Cr)和砷(As)的土壤重金屬污染問題日益嚴(yán)重[7-8]。【前人研究進(jìn)展】近年來，As污染成為中國非常突出且亟需解決的環(huán)境問題[9]，自2001年韋朝陽等[10]以及Ma等[11]報(bào)道發(fā)現(xiàn)蜈蚣草對(duì)重金屬砷具有較強(qiáng)的富集作用以來，一直是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，陳同斌等[12]進(jìn)一步研究了蜈蚣草對(duì)砷富集的作用，隨著對(duì)蜈蚣草富集重金屬砷研究的深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)蜈蚣草在重金屬污染的土壤和水源修復(fù)中的重要作用[13-18]。蕨類植物孢子多，繁殖系數(shù)高。由于近些年生態(tài)環(huán)境變化大，對(duì)其繁殖限制因素多，繁殖效率往往不理想。蜈蚣草一般有成熟孢子繁殖、分株法繁殖和組織培養(yǎng)繁殖等3種繁殖方法[19]。成熟孢子繁殖和分株法繁殖效率不高，耗時(shí)長，目前蜈蚣草的繁殖多集中在利用組織培養(yǎng)方法上。現(xiàn)有的蜈蚣草組織培養(yǎng)技術(shù)，多采用蜈蚣草的孢子萌發(fā)成配子體，再用配子體誘導(dǎo)愈傷組織，最終獲得組培苗。蜈蚣草野外收集孢子和室內(nèi)孢子無菌處理較難，孢子輕、易漂浮，處理過程繁瑣，不易操作，為克服傳統(tǒng)的孢子繁殖帶來的一系列問題，羅麗瓊等[19]以野生蜈蚣草葉芽尖為外植體，通過激素配比試驗(yàn)，成功地篩選出蜈蚣草愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，簡化了組織培養(yǎng)的步驟，能夠在2個(gè)月內(nèi)培育出蜈蚣草幼苗，但未介紹蜈蚣草的成苗率。【本研究切入點(diǎn)】以上介紹蜈蚣草組織培養(yǎng)的方法共性還在于，相關(guān)培養(yǎng)基的配制只是調(diào)整植物激素和大量元素、微量元素、有機(jī)碳源的比例來完成。筆者通過相關(guān)文獻(xiàn)介紹的培養(yǎng)基組合，經(jīng)過多次試驗(yàn)，成苗率很低甚至無法成苗。早在20世紀(jì)就有人針對(duì)難培養(yǎng)的材料，在培養(yǎng)基中附加天然提取物(如椰乳、玉米胚乳、香蕉汁等)，得到了很好的培養(yǎng)效果，尤其在提高分化率和防止褐化效果方面較為顯著。蜈蚣草在培養(yǎng)過程中，褐化較為嚴(yán)重，現(xiàn)有的培養(yǎng)方法是在整個(gè)培養(yǎng)過程中添加防止褐化的物質(zhì)，如活性炭和PVP，增加了過程的繁瑣，也造成相關(guān)試劑的浪費(fèi)。【擬解決的關(guān)鍵問題】目前為止，應(yīng)用天然提取物進(jìn)行蜈蚣草快繁的方法還未見報(bào)道，故本研究應(yīng)用蜈蚣草莖葉的混合勻漿進(jìn)行組織培養(yǎng)，創(chuàng)建了一種極為高效高分化率的快速繁殖體系，解決了蜈蚣草難分化，分化率低、成苗率更低的困難，為獲得優(yōu)質(zhì)壯苗提供重要人工繁殖途徑，形成批量生產(chǎn)蜈蚣草的組織培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以蜈蚣草的幼芽和孢子為基本材料，采自于云南省蒙自市野外正常生長的植株，即將每年3月剛長出的距地面6 cm的幼芽和每年7-8月背面附著深棕色孢子的葉片剪下，用浸濕的吸水紙包好，放入自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 培養(yǎng)基

除預(yù)培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基外，其余的培養(yǎng)基還添加不同種類和濃度水平的植物生長物質(zhì)、不同濃度的蜈蚣草莖葉混合勻漿液、蔗糖20 g/L及瓊脂糖7.8 g/L。各培養(yǎng)基pH值均調(diào)至5.8～6.0，培養(yǎng)基在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基本實(shí)驗(yàn)材料無菌處理 幼芽無菌處理：將幼芽用自來水沖洗，用3 %的洗衣粉充分溶解，浸泡后，再用流動(dòng)的自來水沖洗，用吸水紙吸干多余水分置于超凈臺(tái)上。用70 %～75 %的酒精表面滅活30 s，再用0.1 %氯化汞消毒6～8 min，無菌水沖洗5～6次，用無菌濾紙吸干多余水分，待用。

孢子無菌處理：將附著深棕色孢子的葉片用自來水沖洗，置于超凈臺(tái)上用70 %～75 %的酒精表面滅活1 min，將孢子刮入培養(yǎng)皿中，再轉(zhuǎn)入2 mL的離心管中，用0.1 %氯化汞消毒15 min，3 000 r/min離心5 min，棄上清，無菌水反復(fù)洗5～6次，用無菌濾紙吸干多余水分，待用。

1.3.2 蜈蚣草莖葉勻漿混合液(簡稱為PVCLM)處理 取新鮮的蜈蚣草莖和葉(質(zhì)量比1∶1)用清水清洗后，濾掉水分，按所需要的質(zhì)量體積比打成勻漿，分裝成小瓶，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ脮r(shí)無菌過濾。

1.3.3 預(yù)培養(yǎng)及愈傷組織誘導(dǎo) 幼芽處理方法：無菌處理好的幼芽切下褐化部分，余3 cm幼芽，接入1/2 MS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，待幼嫩葉片展開后，將幼葉，幼莖和頂芽分別切成1 cm左右，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基共設(shè)8個(gè)處理，分別是處理1：1/2 MS+2,4-D 2.0 mg/L；處理2：1/2 MS+PVCLM 50 g/L；處理3：1/2 MS+2,4-D 2.0 mg/L+ PVCLM 50 g/L；處理4：1/2 MS+2,4-D 2.0 mg/L+PVCLM 60 g/L；處理5：1/2 MS+2,4-D 2.0 mg/L+PVCLM 70 g/L；處理6：1/2 MS+2,4-D 2.0 mg/L+ PVCLM 80 g/L；處理7：1/2 MS+2,4-D 2.0 mg/L+PVLM 90 g/L；處理8：1/2 MS+2,4-D 2.0 mg/L+PVLM 100 g/L上，每皿接種6～10個(gè)不同外植體，每種處理5個(gè)重復(fù)。

孢子處理方法：將孢子分別接入8個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理上，每皿接種60～80個(gè)孢子，每種培養(yǎng)基5個(gè)重復(fù)。

將接種處理好的4種外植體，置于溫度(25 ± 2)℃，濕度60 %～70 %的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)到溫度和濕度與暗培養(yǎng)相同，光照2000 lx，光照時(shí)間12 h/d的光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待愈傷組織長出，觀察記錄結(jié)果。

1.3.4 分化為叢生芽的培養(yǎng) 將愈傷切成直徑約為0.3～0.5 cm的小團(tuán)，接入分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基共設(shè)10個(gè)處理，分別是處理1：1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L；處理2：1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 30 g/L；處理3：1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 60 g/L；處理4：1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 80 g/L；處理5：1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 100 g/L；處理6：1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 120 g/L；處理7：1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 150 g/L；處理8：1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 200 g/L；處理9：1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 240 g/L；處理10：1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 280 g/L。每瓶接種20個(gè)，每處理5個(gè)重復(fù)，置于溫度(25 ± 2)℃，濕度50 %～60 %，光照強(qiáng)度3000 lx，光照時(shí)間12 h/d的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后將光照調(diào)至4000 lx，繼續(xù)分化培養(yǎng)，待出現(xiàn)淺綠色芽點(diǎn)并分化出纖細(xì)小苗，即形成叢生芽。

1.3.5 叢生芽繼代分化為叢生苗的培養(yǎng) 將長出的叢生芽接入不同處理的10個(gè)分化培養(yǎng)基上繼續(xù)分化，每瓶接種20個(gè)，每種培養(yǎng)基5個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)條件與分化培養(yǎng)一致，待叢生芽長成獨(dú)立小苗(叢生苗同時(shí)長出)時(shí)，記錄結(jié)果。

1.3.6 生根培養(yǎng) 將3～4 cm綠而壯的小苗接入裝有生根培養(yǎng)基的玻璃瓶中，生根培養(yǎng)基共設(shè)9個(gè)處理，處理1：1/4 MS+NAA 0.2 mg/L；處理2：1/4 MS+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 30 g/L；處理3：1/4 MS+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 50 g/L；處理4：1/4 MS+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 100 g/L；處理5：1/4 MS+IAA 0.5 mg/L；處理6：1/4 MS+IAA 0.5 mg/L+ PVCLM 30 g/L；處理7：1/4 MS+IAA 0.5 mg/L+PVCLM 50 g/L；處理8：1/4 MS+IAA 0.5 mg/L+VCLM 100 g/L；處理9：1/4 MS+IAA 0.5 mg/L+PVCLM 150 g/L。生根培養(yǎng)每瓶接種20個(gè)，每種培養(yǎng)基5個(gè)重復(fù)，置于溫度(25 ± 2)℃，濕度50 %～60 %，光照強(qiáng)度3000 lx，光照時(shí)間12 h/d的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待根芽長出，主根長至2 cm時(shí)生根苗即能假植，記錄結(jié)果。

1.3.7 煉苗與移栽 將主根長至2 cm的生根苗置于溫室苗床上，保持環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度50 %～80 %，自然光照進(jìn)行煉苗，增強(qiáng)幼苗對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。14 d后將附在生根苗上的培養(yǎng)基沖洗掉，置于大口瓶中，加水將小苗根部淹沒，蓋上透氣膜，3 d后掀膜開口煉苗，每天換水，待苗緩活后移栽至溫室，并記錄成活率。

1.3.8 田間種植與管理 將溫室定植苗移栽至礦區(qū)尾礦庫，移栽前將地翻犁，地按一壟一壟整理好，每壟間隔40 cm，種植株距20 cm，苗種下后，上面覆蓋植物秸稈，將水澆透，常規(guī)水肥管理，待苗長至1～1.2 m，并且成蓬生長，枝葉茂盛時(shí)，采樣用于分析檢測其中砷富集含量，檢測樣送云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼芽預(yù)培養(yǎng)

為研究蜈蚣草的幼葉、幼莖和頂芽愈傷組織誘導(dǎo)情況，將無菌處理好的幼芽接種于1/2 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，7 d后大部分幼芽的幼嫩葉片展開(圖1-A)，形成了幼葉、幼莖和頂芽，這3個(gè)外植體可直接用于愈傷組織的誘導(dǎo)。

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

將幼葉、幼莖、頂芽和孢子4種外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，5 d后愈傷組織萌發(fā)，統(tǒng)計(jì)所有處理的愈傷誘導(dǎo)率，結(jié)果見表1和圖1-B。頂芽和莖在8種培養(yǎng)基中均未誘導(dǎo)出愈傷組織，孢子在處理2中未出現(xiàn)萌動(dòng)的跡象，在其余7種培養(yǎng)基都有萌動(dòng)跡象，在處理6中萌動(dòng)效果最好，但愈傷誘導(dǎo)率只能達(dá)到1 %。葉片在處理2中未出現(xiàn)萌動(dòng)的跡象，在其余7種處理都有萌動(dòng)跡象，在處理4中萌動(dòng)效果最好，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到100 %。所以，結(jié)果表明，4種外植體中，最適合愈傷組織誘導(dǎo)的外植體為幼葉，其次是孢子，頂芽和莖最差。最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為處理4的培養(yǎng)基，即1/2 MS+2,4-D 2.0 mg/L+PVCLM 60 g/L+瓊脂粉7.8 g/L+蔗糖20 g/L，pH 5.8～6.0。

2.3 愈傷分化為叢生芽的培養(yǎng)

將成團(tuán)的愈傷切成直徑為0.3～0.5 cm的小團(tuán)，接入10個(gè)不同處理的分化培養(yǎng)基中，每培養(yǎng)2 d觀察1次，5 d后大部分組合培養(yǎng)基上有大量叢生芽時(shí)(圖1-C)，統(tǒng)計(jì)分化率，從表2可看出，處理8是最佳的分化培養(yǎng)基，分化率達(dá)98.3 %。由此可見，愈傷分化為叢生芽的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 200 g/L+瓊脂粉7.8 g/L+蔗糖20 g/L，pH 5.8～6.0。

表1 蜈蚣草愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)

表2 蜈蚣草愈傷分化為叢生芽的培養(yǎng)

2.4 叢生芽繼分化為叢生苗的培養(yǎng)

將長出的叢生芽接入10個(gè)不同處理的分化培養(yǎng)基上繼續(xù)分化，每培養(yǎng)2 d觀察1次，出現(xiàn)叢生苗時(shí)，統(tǒng)計(jì)叢生苗形成情況，5 d后大部分組合培養(yǎng)基上有大量叢生苗時(shí)(圖1-D)，統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)，從表3可看出，處理8是最佳的繼代分化培養(yǎng)基，增殖系數(shù)可達(dá)1.1 %，同時(shí)又長出新的叢生芽和新的愈傷組織。由此可見，叢生芽繼分化為叢生苗的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 200 g/L+瓊脂粉7.8 g/L+蔗糖20 g/L，pH 5.8～6.0。

表3 蜈蚣草叢生芽繼分化為叢生苗的培養(yǎng)

表4 蜈蚣草的生根培養(yǎng)

2.5 生根培養(yǎng)

將叢生苗切成獨(dú)立苗接種于9組生根培養(yǎng)基中，每培養(yǎng)2 d觀察1次，開始生根時(shí)，統(tǒng)計(jì)生根形成情況，培養(yǎng)15 d后，大部分組合培養(yǎng)基上都已生根時(shí)(圖1-E)，統(tǒng)計(jì)生根率、平均主根長、平均根粗和須根數(shù)量(圖1-F)，從表4可看出，處理1和處理5中的生根率都比其它組合都高，但處理1的主根比處理5的長，所以綜合考慮，處理1是最佳的生根培養(yǎng)基，即1/4 MS+NAA 0.2 mg/L+瓊脂粉7.8 g/L+蔗糖20 g/L，pH 5.8～6.0。

A：幼嫩葉片預(yù)培養(yǎng)；B：葉片誘導(dǎo)愈傷；C：叢生芽形成；D：叢生苗培養(yǎng)；E：生根培養(yǎng)；F：主根，須根培養(yǎng)；G：田間種植蜈蚣草；H：待收割蜈蚣草A: Young leaf preculture; B: Callus induction; C: Cluster buds; D: Adventitious bud multiplication; E: Rooting culture; F: Taproot and fibrous root culture; G: The seedlings in field; H: Mature plants圖1 蜈蚣草的叢生芽誘導(dǎo)和植株再生Fig.1 Bud induction and plantlet regeneration of Pteris vittata

2.6 煉苗與移栽

出瓶的生根苗，在溫度20～25 ℃、濕度50 %～80 %、自然光照的溫室環(huán)境下，7 d時(shí)大部分苗開始長出新根，苗已開始緩活，10 d后大部分苗已存活，統(tǒng)計(jì)成活率，成活率可達(dá)98 %，此時(shí)即可植入大田備用或直接應(yīng)用于目的地。

2.7 蜈蚣草田間生長及產(chǎn)量

從圖1-G可以看出，大面積種植蜈蚣草，整地按壟有利于根長的生長，土壤不易板結(jié)，又有利保水。株距保持一定寬度也有利于后期植株的蓬勃生長。覆蓋植物秸稈不僅起到遮陰保濕的作用，還能利用秸稈腐化過程不斷提供有機(jī)肥料。當(dāng)蜈蚣草葉片枯萎時(shí)，進(jìn)行統(tǒng)一收割(圖1-H)。對(duì)蜈蚣草地上部分進(jìn)行砷含量檢測為830 mg/kg，干重達(dá)到3996.5 kg/hm2，則第一季蜈蚣草可從尾礦庫中提取砷3318 g/hm2。第二年春天蜈蚣草又會(huì)萌發(fā)新芽長成植株，重新對(duì)尾礦庫土壤進(jìn)行修復(fù)。

3 討 論

3.1 外植體的選擇

外植體是指植物組織培養(yǎng)中的各種接種材料。從理論上講，植物細(xì)胞都具有全能性，能夠再生新植株，任何器官、任何組織、單個(gè)細(xì)胞和原生質(zhì)體都可以作為外植體。但實(shí)際上，不同品種、不同器官之間的分化能力有巨大差異，培養(yǎng)的難易程度不同。為保證植物組織培養(yǎng)獲得成功，選擇合適的外植體是非常重要的。

采用蜈蚣草的不同外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，已有相關(guān)研究，尹懷約[20]直接應(yīng)用蜈蚣草的葉片和葉柄進(jìn)行離體培養(yǎng)，成功獲得完整植株；石曉云等[21]、孫靜賢等[22]和周向軍[23]利用孢子進(jìn)行蜈蚣草組織培養(yǎng)，成功建立了蜈蚣草的組培體系；羅利瓊等[19]應(yīng)用葉芽尖為外植體，建立了一種方便快速的蜈蚣草組培方法。但何種外植體組織培養(yǎng)效果最好，未見相關(guān)研究報(bào)道，本研究將幼葉、幼莖、頂芽和孢子作為外植體，比較這4種外植體組織培養(yǎng)效果，在本研究中幼葉、幼莖和頂芽這3種外植體不是直接采集于野外生長的植株，而是首先將野外采集的幼芽進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，獲得幼葉、幼莖和頂芽，這樣既減少污染，也簡化了實(shí)驗(yàn)步驟。從研究結(jié)果可看出，蜈蚣草的幼葉是最佳誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，其次為孢子，幼莖和頂芽基本誘導(dǎo)不出愈傷組織。綜合研究結(jié)果可見，在選擇蜈蚣草的外植體材料時(shí)，以選擇幼葉為最佳，幼葉不僅誘導(dǎo)率高，獲取途徑也方便，來源受季節(jié)變化影響不大，可在春季采集幼芽進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，將幼葉剪去備用，再將頂芽轉(zhuǎn)接入新的培養(yǎng)基進(jìn)行無限保存。

3.2 組培中天然提取物的應(yīng)用

在長期的組織培養(yǎng)實(shí)踐中，人們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基內(nèi)加入某些天然有機(jī)添加物，能夠增強(qiáng)培養(yǎng)物的生長、分化效應(yīng)，促進(jìn)培養(yǎng)物更好地存活、發(fā)育。由于添加天然有機(jī)物的培養(yǎng)基容易配制，成本低廉，對(duì)器官分化、細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用，植物及微生物在其中生長良好，所以適于在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[24]。對(duì)于蜈蚣草的組織培養(yǎng)，添加常規(guī)的植物激素，組培效果較差，分化效率較低。鑒于天然提取物的有益效果，本研究將蜈蚣草的莖和葉按質(zhì)量比1∶1打成混合勻漿，進(jìn)行滅菌處理，應(yīng)用于蜈蚣草的組織培養(yǎng)，研究結(jié)果顯示，蜈蚣草的莖和葉混合勻漿不僅很好的防止了褐化，并且大大提高了分化率。

組織培養(yǎng)中常用的天然有機(jī)物包括椰乳、香蕉汁、蘋果汁、番茄汁、胡蘿卜汁、馬鈴薯汁等，并且這些天然有機(jī)物被廣泛地應(yīng)用于不同物種的組培，應(yīng)用于蘭科植物研究的較多[25]。這些天然提取物是否也可以很好的應(yīng)用于蜈蚣草的組織培養(yǎng)，有待后續(xù)試驗(yàn)研究。

3.3 蜈蚣草組培苗對(duì)砷的富集應(yīng)用

依靠自然條件在較短時(shí)間內(nèi)繁殖稀有植物和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的植物，受到地理環(huán)境和季節(jié)的限制，很難達(dá)到快速、高效的目的；特別對(duì)于在短時(shí)期內(nèi)需要達(dá)到一定數(shù)量，才能創(chuàng)造應(yīng)有價(jià)值的植物，時(shí)間就是效益，只有通過組織培養(yǎng)的方法才能滿足這一要求。由于組織培養(yǎng)法繁殖植物的優(yōu)勢在于快速，每年可以數(shù)以百倍速度繁殖，因此對(duì)一些繁殖系數(shù)低，不能用種子繁殖的名特優(yōu)植物品種的繁殖，意義尤為重大。由于蜈蚣草為孢子植物，在自然界中發(fā)芽率極低，而且競爭力極弱，僅靠傳統(tǒng)的孢子繁殖要獲得大量的種苗耗時(shí)長。蜈蚣草在砷污染土壤或水體的治理中有巨大的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)，通過研究蜈蚣草的組培的關(guān)鍵技術(shù)，摸索出一套可進(jìn)行組培快繁工廠化生產(chǎn)的技術(shù)體系，并且將組培苗應(yīng)用于田間對(duì)砷的富集，第一季蜈蚣草從尾礦庫中提取砷3318 g/hm2。研究發(fā)現(xiàn)[11]，蜈蚣草的羽葉含砷量最高，人工栽培會(huì)使蜈蚣草羽葉含砷量增加，且隨著種植時(shí)間的延長而增加，這研究結(jié)果表明，可通過組織培養(yǎng)快速繁殖優(yōu)良的蜈蚣草株系，種植于砷污染的土壤，并且每年進(jìn)行地上部分的修剪可大大提高蜈蚣草對(duì)砷污染的修復(fù)能力。

4 結(jié) 論

通過試驗(yàn)表明，蜈蚣草幼葉為組培的最佳外植體，其次是孢子，頂芽和莖最差。1/2MS+2,4-D 2 mg/L+PVCLM 60 g/L為最佳的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)100 %；1/2MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 200 g/L為最佳分化培養(yǎng)基，分化率達(dá)98.3 %；1/2MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVCLM 200 g/L為最佳的叢生芽增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)達(dá)1.1；1/4MS+NAA 0.2 mg/L為最佳生根培養(yǎng)基，生根率98 %，以上涉及的培養(yǎng)基中瓊脂濃度為7.8 g/L，蔗糖濃度為20 g/L，pH為5.8～6.0。組培苗移栽至尾礦庫栽種，成熟后檢測蜈蚣草中富集的砷的量達(dá)到3318 g/hm2。本研究摸索出一套適合工廠化的蜈蚣草組培快繁技術(shù)體系，解決了蜈蚣草難分化、分化率低，成苗率更低的困難，為獲得優(yōu)質(zhì)壯苗提供了重要的人工繁殖途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1]浙江植物志編委會(huì).浙江植物志[M].杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社, 1993.

[2]安徽經(jīng)濟(jì)植物志編寫組.安徽經(jīng)濟(jì)植物志[M].合肥:安徽科學(xué)技術(shù)出版社, 1990.

[3]福建科學(xué)技術(shù)委員會(huì)福建植物志編寫組.福建植物志(第1卷)[M].福州:福建科學(xué)技術(shù)出版社, 1982.

[4]安徽植物志協(xié)作組.安徽植物志(第1卷)[M].合肥:安徽科技出版社, 1984.

[5]丁寶章,王遂義,高增義.河南植物志(第一冊)[M].鄭州:河南人民出版社, 1988.

[6]浙江植物志編委會(huì).浙江植物志[M].杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社, 1993.

[7]宋 偉,陳百明,劉 琳.中國耕地土壤重金屬污染概況[J].水土保持研究, 2013, 20(2): 293-298.

[8]張 東,張楚兒.北河流域土壤重金屬污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及影響因素分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 28(5): 2187-2193

[9]申紅玲,何振艷,麻 密.蜈蚣草砷超富集機(jī)制及其在砷污染修復(fù)中的應(yīng)用[J].植物生理學(xué)報(bào), 2014, 50(5): 591-598.

[10]韋朝陽,陳同斌.重金屬超富集植物及植物修復(fù)技術(shù)研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報(bào), 2001, 21(7): 1196-1203.

[11]Ma L Q, Komar K M, Tu C,etal. A fern that hyperaccumulates arsenic[J]. Nature, 2001, 409: 579.

[12]陳同斌,韋朝陽,黃澤春,等.砷超富集植物蜈蚣草及其對(duì)砷的富集特征[J].科學(xué)通報(bào), 2002, 47(3): 207-210.

[13]Campos V, Aparecida M, Pires F. Phytoremoval of arsenic from soil[J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 2004, 35(15-16): 2137-2146.

[14]Caille N, Zhao F J, McGrath S P. Comparison of root absorption, translocation and tolerance of arsenic in the hyperaccumulatorPterisvittataand the nonhyperaccumulatorPteristremula[J]. New Phytologist, 2005, 165: 755-761.

[15]Zhao F J, Wang J R, Barker J H A, et al. The role of phytochelatins in arsenic tolerance in the hyperaccumulatorPterisvittata[J]. New Phytologist, 2003, 159(2): 403-410.

[16]Fayiga A O, Ma L Q, Cao X D, et al. Effects of heavy metals on growth and arsenic accumulation in the arsenic hyperaccumulatorPterisvittataL[J]. Environmental Pollution, 2004, 132(2): 289-296.

[17]安志裝,陳同斌,雷 梅,等.蜈蚣草耐鉛、銅、鋅毒性和修復(fù)能力的研究[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2003, 23(12): 2594-2598.

[18]陳曉清,蘇育才.蜈蚣草的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].生物學(xué)教學(xué), 2013, 38(2): 7-9.

[19]羅利瓊,張 軍,羅 旭,等.鳳尾蕨科植物蜈蚣草的組織培養(yǎng)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(29): 17802-17803, 17864.

[20]尹懷約.蜈蚣草的組織培養(yǎng)[J].四川師范學(xué)報(bào), 1991, 12(1): 20-22.

[21]石曉云,唐偉斌,石肖凌.蜈蚣草孢子組織培養(yǎng)與快繁研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008, 36(25): 10775.

[22]孫靜賢,高云濤,張 繼,等.蜈蚣草組織培養(yǎng)與自然播種繁殖的比較研究[J].北方園藝, 2013(5): 91-93.

[23]周向軍.砷超富集植物蜈蚣草的離體培養(yǎng)及植株再生[J].資源開發(fā)與市場, 2010, 26(8): 676-678.

[24]曹孜義,劉國民.實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M].蘭州: 甘肅科學(xué)技術(shù)出版社, 1996.

[25]李 亮,張冬敏,雷華輝,等.植物組織培養(yǎng)中有機(jī)添加物應(yīng)用研究[J].寧夏農(nóng)林科技, 2012, 53(2): 28-30, 34.