腸道病毒71型通過下調IRF9的蛋白水平抑制干擾素的抗病毒作用*

王春陽 魏蘭蘭 嚴琴琴 嚴喜章 白 丹 倪 菁 杜向陽

(西安醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，西安 710021)

腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)是引起手足口病的主要病原體。EV71屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬，單股正鏈RNA病毒。近年來因其會引起重癥患兒神經系統(tǒng)并發(fā)癥甚至死亡而引起國內外廣泛關注。大部分EV71感染的患兒主要表現(xiàn)為手足口臀部的皰疹，一周內可自愈。少部分病例會出現(xiàn)神經系統(tǒng)并發(fā)癥，如腦干腦炎、脊髓灰質炎樣麻痹，甚至出現(xiàn)神經源性肺水腫、肺出血，最終危及生命。目前臨床上針對EV71感染的治療主要為對癥治療和支持治療，尚無有效的抗病毒藥物以及上市的疫苗。盡管幾十年來干擾素(Interferon，IFN)作為臨床一線的抗病毒藥物被用來治療多種病毒的感染，但臨床上用IFN治療EV71感染的效果卻并不顯著[1]。并且體外實驗表明，只有高劑量提前應用IFN才能對EV71感染的Vero細胞有一定的保護作用[2]。因此EV71必然存在可以拮抗IFN-β反應的機制。

IFN-β發(fā)揮其抗病毒作用依賴于JAK-STAT信號通路。IFN-β首先與其受體結合，引起與受體相連的JAK激酶磷酸化，進一步誘導下游STAT1和STAT2的磷酸化，然后與胞漿中的IRF9一起組合成磷酸化的復合物ISGF3，ISGF3入核誘導成千上萬的抗病毒基因(ISGs)的表達[3,4]。

迄今為止，對EV71感染后抑制JAK-STAT信號通路的具體機制仍不明確，亟待進一步研究。Lu等[5]的研究發(fā)現(xiàn)EV71 2A 蛋白能夠裂解IFN受體IFNAR1，降低IFN與其受體的結合，從而抑制IFN的下游信號通路。然而，另外一項研究表明，EV71并不是通過降低干擾素受體IFNAR1的蛋白水平，而是通過降低JAK1的蛋白水平，來阻斷Ⅰ型IFN的反應[6]。本研究旨在通過研究JAK-STAT信號通路，探究EV71感染抑制IFN-β抗病毒作用的具體機制，從而為今后EV71感染的治療提供思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞和病毒 人橫紋肌肉瘤RD 細胞購自美國典型培養(yǎng)物中心(American type culture collection，ATCC)； EV71病毒(阜陽株)由江蘇省疾病預防與控制中心惠贈。

1.1.2試劑和儀器 反轉錄試劑盒、SYBR熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司；Anti-phosphorylated STAT1抗體、Anti-STAT1、Anti-histone H1、Anti-IRF-9 (D2T8M) 抗體購自美國Cell signaling公司；Anti-GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG購自武漢巴傲得生物科技有限公司；StepOneTMReal-time PCR 儀器為美國ABI公司產品；NANODROP 2000核酸定量儀為美國Thermo公司產品；凝膠成像儀和水平電泳儀為美國Bio-Bad公司產品。

1.2實驗方法

1.2.1細胞分組 本實驗分為4組，包括正常對照組(Control組)、EV71病毒對照組(EV71組)、僅有IFN-β處理組(IFN-β組)、EV71+IFN-β處理組(EV71+IFN-β組)。

1.2.2免疫印跡檢測 EV71以MOI為1感染RD細胞，為感染組做對照，24 h后，加入IFN-β(終濃度為20 ng/ml)共同孵育30 min。棄去上清，預冷的PBS洗滌3次后用1×SDS sample buffer冰上裂解細胞蛋白20 min，4℃ 12 000×g離心10 min，將上清轉移至新離心管中。用于后續(xù)PAGE和Western blot實驗。電泳后將細胞蛋白轉移到PVDF膜上，用5%的小牛血清(BSA)室溫封閉1 h，然后將膜與含一抗的封閉液一起孵育，4℃靜置過夜。用TBST漂洗膜3次，每次10 min。再將膜與含二抗的封閉液一起室溫孵育2 h。TBST漂洗膜3次，每次10 min。然后將膜放于凝膠成像儀中拍照。

1.2.3細胞核和細胞質蛋白分離 感染和未感染的RD細胞在IFN-β處理30 min后，根據(jù)核質抽提試劑盒(P0027，碧云天，江蘇，中國)說明書先配好相關試劑，放于冰上備用。用PBS將細胞清洗3遍，然后用EDTA溶液處理細胞，離心收集細胞至新的EP管中，盡量吸盡上清，留下沉淀。然后根據(jù)試劑盒說明書進行核質蛋白抽提。將抽提的蛋白放于-70℃凍存。胞核和胞漿成分用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，用于后續(xù)的電泳實驗。

1.2.4實時熒光定量PCR(Real-time PCR)測定ISGs mRNA的表達 根據(jù)RNA提取試劑盒(Qiagen，Germany)說明書提取感染細胞和未感染細胞的總RNA。用美國Thermo公司的Nanodrop測定RNA的濃度與純度。按照TaKaRa公司的2 Step Real-time RT-PCR逆轉錄試劑盒(RRO36A)說明書，取500 ng RNA反轉錄成cDNA。然后用獲得的cDNA作為模版按照TaKaRa的SYBR熒光定量Real-time PCR試劑盒(RR420A)的說明書配制PCR反應液，然后在Applied Biosystems StepOnePlusTM儀器上進行熒光定量反應。PCR反應條件是：95℃預變性30 s，然后95℃ 5 s 60℃ 30 s,進行40個循環(huán)。內參基因選取磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因。每個3個孔，每次實驗重復3次。基因的表達水平按照公式2(ΔCt of Gene-ΔCt of GAPDH)進行計算。各種ISGs的引物序列見表1。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1EV71 抑制ISGs的產生 EV71以MOI為1感染RD細胞24 h，隨后用IFN-β處理細胞，24 h后提取總RNA，并用Real-time PCR法檢測ISGs的表達。結果顯示，OAS1、MX1、ISG54 mRNA表達水平在EV71組和未感染組并無明顯差別。IFN-β組與Control組相比，OAS1、 MX1、ISG54 mRNA表達水平明顯升高，分別上調約74倍、79倍、121倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；EV71+IFN-β組與Control組相比，OAS1、 MX1、ISG54 mRNA表達水平也明顯升高，分別上調約27倍、29倍、73倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但EV71+IFN-β組與IFN-β組相比，OAS1、 MX1、ISG54 mRNA表達水平明顯降低，分別下降約47%、50%和48%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)，提示EV71感染抑制了IFN-β誘導的ISGs mRNA的表達。

表1ISGs的引物序列

Tab.1PrimersforISGs

GenenameForwardprimerReverseprimerβ-actinATGGATGACGATATCGCTGATGAGGTAGTCTGTCAGGTOAS1CCAAGCTCAAGAGCCTCATCTGGGCTGTGTTGAAATGTGTMX1GGGAAGGAATGGGAATCAGTCCCACAGCCACTCTGGTTATISG54AGCGAAGGTGTGCTTTGAGAGAGGGTCAATGGGCGTTCTGA

圖1 EV71 抑制IFN誘導ISGs的產生Fig.1 EV71 inhibited induction of ISGs stimulated by IFN-β

圖2 EV71感染并不影響STAT1/2的磷酸化水平和蛋白水平Fig.2 EV71 did not affect phosphorylation and expression of STAT1/2

2.2EV71感染并不影響STAT1/2的磷酸化水平和蛋白水平 EV71以MOI為1感染RD細胞24 h，隨后用IFN-β處理細胞，24 h后提取總蛋白，并應用免疫印跡技術檢測STAT1/2的磷酸化水平和蛋白水平。結果顯示，與Control組相比，IFN-β組和EV71+IFN-β組STAT1和p-STAT1的蛋白水平明顯升高，表達量無明顯差異(圖2)，提示EV71感染并不影響STAT1的蛋白水平和磷酸化過程。

2.3EV71抑制p-STAT1的入核 EV71感染RD細胞24 h后，加入IFN-β處理細胞30 min，分別提取細胞胞漿蛋白和核蛋白，用免疫印跡法檢測p-STAT1在細胞中的定位情況，未感染組做對照。結果表明，IFN-β組，p-STAT1主要定位在胞核中(圖3)，而EV71+IFN-β組的p-STAT1主要定位在胞漿中，提示EV71可能抑制了p-STAT1的核轉位。

2.4EV71感染能夠降低IFN-β誘導的IRF9的表達 EV71感染RD細胞24 h后，加入IFN-β處理細胞30 min，然后提取細胞總蛋白，應用免疫印跡技術檢測IRF9蛋白的表達。結果表明，在IFN-β組細胞中，IRF9的表達明顯上調；而與IFN-β組相比，EV71+IFN-β組IRF9的蛋白水平明顯下調(圖4)，提示EV71感染抑制了IFN-β誘導的IRF9的表達。

圖3 EV71抑制p-STAT1的入核Fig.3 EV71 inhibited translocation of p-STAT1

圖4 EV71抑制IFN-β誘導的IRF9的表達Fig.4 EV71 inhibited expression of IRF9 induced by IFN-β

綜上，EV71可能是通過下調IRF9的表達來抑制IRF9與p-STAT1的相互作用，進而阻斷ISGF3的核轉位。

3 討論

EV71是目前繼脊髓灰質炎病毒后又一個引起神經系統(tǒng)并發(fā)癥的腸道病毒。臨床上尚無有效的抗EV71病毒的藥物和疫苗。IFN-β作為天然免疫的第一道防線，因其具有廣泛的抗病毒效應而在臨床上被用于各種病毒感染的治療。然而IFN-β治療EV71感染的患兒卻療效甚微，其機制亟待研究。高劑量的IFN的確可以提高EV71感染小鼠的生存率，但是高劑量的IFN因其有不可忽視的副作用而不能用于臨床。病毒在長期演化中進化出了各種各樣的策略來逃逸或對抗IFN介導的宿主抗病毒免疫反應。據(jù)報道，病毒可以通過多種機制抑制IFN-β的抗病毒作用。比如流感病毒非結構蛋白NS1可以抑制STAT1/2的磷酸化，抑制下游的相關信號轉導[7]。腺病毒的E1A蛋白能夠降低STAT1和IRF9的蛋白水平，從而阻斷ISGF3的形成[8,9]。呼腸孤病毒 μ2蛋白能促使IRF9 在細胞核內的不正常累積，導致IRF9核輸出障礙[10]。目前關于EV71抑制IFN的JAK-STAT信號通路的具體機制研究尚少。Lu等[5]的研究發(fā)現(xiàn)EV71 2A 蛋白能夠裂解IFN的受體IFNAR1，從而降低IFN與其受體的結合，抑制IFN的下游信號通路。然而，另外一項研究表明，EV71并不是通過降低IFN受體IFNAR1的蛋白水平，而是通過降低JAK1的蛋白水平，來阻斷Ⅰ型IFN的反應[6]。關于EV71如何逃逸IFN的抗病毒作用仍然存在爭議，因此妨礙了IFN將來用于治療臨床上的重癥患者。

本研究以EV71感染人橫紋肌肉瘤細胞建立感染模型，在此基礎上研究了EV71與外源性IFN-β的相互作用過程。我們發(fā)現(xiàn)EV71感染并不影響IFN-β誘導的p-STAT1的磷酸化和其蛋白的表達，說明在IFN-β作用過程中，EV71對JAKs的激活并沒有明顯的影響。并且在EV71感染過程中，IFN-β雖然能夠誘導STAT1 的磷酸化，但p-STAT一直停留在胞漿中，并沒有入核，說明EV71能夠抑制其核轉位。進一步研究發(fā)現(xiàn)這種抑制作用可能通過下調IRF9的蛋白水平，進而抑制IRF9與p-STAT1的相互作用。

參考文獻：

[1] Liu ML,Lee YP,Wang YF,etal.Type I interferons protect mice against enterovirus 71 infection[J].J Gen Virol,2005,86(Pt 12):3263-3269.

[2] Yi L,He Y,Chen Y,etal.Potent inhibition of human enterovirus 71 replication by type I interferon subtypes[J].Antivir Ther,2011,16(1):51-58.

[3] Darnell JE,Kerr IM,Stark GR.Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins[J].Science,1994,264(5164):1415-1421.

[4] Platanias LC.Mechanisms of type-I-and type-II-interferon-mediated signalling.[J].Nat Rev Immunol,2005,5(5):375-386.

[5] Lu J,Yi L,Zhao J,etal.Enterovirus 71 disrupts interferon signaling by reducing the level of interferon receptor 1[J].J Virol,2012,86(7):3767-3776.

[6] Liu Y,Zhang Z,Zhao X,etal.Enterovirus 71 inhibits cellular type I interferon signaling by downregulating JAK1 protein expression[J].Viral Immunol,2014,27(6):267-276.

[7] Jia D,Rahbar R,Chan RWY,etal.Influenza virus non-structural protein 1 (NS1) disrupts interferon signaling[J].PLoS One,2010,5(11):e13927.

[8] Leonard GT,Sen GC.Effects of Adenovirus E1A Protein on Interferon-Signaling[J].Virology,1996,224(1):25-33.

[9] Leonard GT,Sen GC.Restoration of interferon responses of adenovirus E1A-expressing HT1080 cell lines by overexpression of p48 protein.[J].J Virol,1997,71(7):5095-5101.

[10] Zurney J,Kobayashi T，Holm GH,etal.Reovirus mu2 protein inhibits interferon signaling through a novel mechanism involving nuclear accumulation of interferon regulatory factor 9[J].J Virol,2009,83(5):2178-2187.