地塞米松體外短期處理影響Ⅰ型調節性T細胞與自然調節性T細胞平衡*

黃麗艷 歐志兵 謝 婷 廖湘平 張 健 劉文培 瞿小旺

(南華大學附屬郴州醫院轉化醫學研究所，郴州 423000)

糖皮質激素是免疫系統重要的調節器，內源性激素對新陳代謝、生長發育等許多生理過程都極其重要，還可以保護機體免受強烈免疫反應的不良影響。1948年以來，合成的糖皮質激素由于其強有力的抗炎和免疫抑制活性，被廣泛應用于治療多發性硬化、系統性紅斑狼瘡、關節炎等自身免疫性疾病、過敏、腫瘤以及器官移植后預防排斥反應[1-4]。然而糖皮質激素的分解活動會在間質組織中引起嚴重的副作用，如皮膚萎縮、肌無力和骨質疏松；而糖皮質激素在肝臟的新陳代謝尤其是糖異生會導致胰島素抵抗和糖尿病。因此，在分子水平上理解這種多效激素對不同細胞類型的特異性影響，是維持糖皮質激素的治療效果和克服副作用發展策略所必需的。

調節性T細胞(Treg)，是1995年由Sakaguchi等[5]首次報道的一種具有免疫抑制作用的T細胞亞群，其表型為CD4+Foxp3+CD25+T[6]。Treg在機體免疫穩態、 移植耐受、 腫瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病等過程中都發揮重要作用，是維持機體免疫耐受的重要調控者[7,8]。Ⅰ型調節性T細胞(Tr1)作為誘導性調節T細胞，表型為CD4+CD25-LAG-3+T，主要通過分泌 IL-10、TGF-beta等物質而發揮免疫負調控作用[9]。Tr1在過敏性疾病及器官移植后發揮免疫耐受作用[10,11]，在炎癥性腸病中Tr1可以進入炎癥部位發揮抗炎作用[12]；Tr1缺乏或功能受損會導致多發性硬化等自身免疫性疾病[13]；然而Tr1過多會導致腫瘤細胞的擴增和免疫逃逸[14]。在丙型病毒性肝炎患者的肝臟組織內Tr1過表達會導致干擾素治療的無反應性，從而進展為肝炎后肝硬化和肝癌[15]。

調節性T細胞在有炎癥性疾病的人和小鼠體內都可以被地塞米松誘導[16,17]，地塞米松可以恢復過敏癥患者體內調節性T細胞的數量和功能[18]，然而機制尚不明確。本研究擬通過地塞米松體外短期處理外周血淋巴細胞，探究地塞米松對調節性T細胞平衡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑

1.1.1研究對象 收集健康人外周血樣，所有納入對象均無肝炎、艾滋、梅毒等血液傳播疾病，近期均未使用過糖皮質激素。該研究在郴州市第一人民醫院倫理委員會和志愿者知情同意下進行。

1.1.2流式抗體 鼠抗人CD3 APC-eFluor 780(SK7)、鼠抗人CD8a APC(OKT8)、鼠抗人CD127 APC(eBioRDR5)、兔抗人Foxp3 PE-eFluor?610(PCH101)購于美國eBioscience公司；鼠抗人CD4 BUV737(SK3)、鼠抗人CD8 BUV737(SK1)、鼠抗人CD25 PE-CyTM5(M-A251)購于美國BD公司；鼠抗人LAG-3 FITC(17B4)購于美國Lifespan公司。

1.1.3儀器 應用MOFLO XDP流式細胞儀(美國BECKMAN公司) 獲取并分析細胞，FlowJo.10.0軟件分析流式數據。

1.2實驗方法

1.2.1細胞準備 取外周血8～10 ml肝素鈉抗凝，在離心管中加入2倍血液體積的淋巴細胞分離液，2 200 r/min離心22 min，然后吸出中間白細胞層加入到裝有15 ml RPMI1640的離心管1 800 r/min離心6 min，棄上清，將細胞用1 ml 10%FBS+RPMI1640完全培養基重懸計數，然后每孔以0.2～0.25(106)個淋巴細胞轉至96孔平底板中，用地塞米松(109～105mol/L)或10%FBS+RPMI1640完全培養基200 μl/孔處理3 d，流式檢測相應細胞標志物。

1.2.2細胞表面染色 按多色分析法進行染色，以1∶1 000比例稀釋Livedead，每孔加100 μl稀釋好的Livedead，室溫30 min避光孵育，染抗體前加5% Fc Receptor Blocking Solution 25 μl/孔，室溫培養 5 min，以阻斷Fc受體非特異性結合。然后以50 μl/孔的總體系表面染CD3、CD4、CD8、CD127、CD25、LAG-3室溫避光30 min，1 800 r/min離心4 min、洗滌，重復3次。

1.2.3Foxp3染色 表面染后根據Foxp3 Perm/Fix試劑盒說明書室溫下40 min避光破核膜，3次離心洗滌后染Foxp3抗體。

1.3統計學處理 應用SPSS.20統計軟件進行統計學處理，正態分布用t檢驗，非正態分布用Mann-WhitneyU檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1地塞米松體外短期處理增加CD4+T細胞頻率且呈劑量依賴性 為了探討地塞米松對CD4+T細胞的影響，我們用不同濃度(109～105mol/L)的地塞米松處理健康人外周血淋巴細胞3 d，發現與對照組相比，地塞米松處理后CD4+T細胞的頻率顯著增高(圖1)(P值分別為P=0.058、P=0.009、P=0.006、P=0.02、P=0.003)，且隨著濃度的增加均值增大，提示地塞米松增加CD4+T細胞的頻率，且呈劑量依賴性。

圖1 地塞米松對CD4+T細胞頻率的影響(n=10) Fig.1 Effect of dexamethasone on frequency of CD4+T cells(n=10)Note: A.Flow analysis diagram of CD4+T cells；B.The effect of different doses of dexamethasone on CD4+T cells frequency.

圖2 地塞米松對CD4+T細胞表型的影響(n=12) Fig.2 Effect of dexamethasone on phenotype of CD4+T cells(n=12) Note: A.Flow analysis diagram of CD4+T cell phenotype；B.The effect of dexamethasone on the expression of CD25，Foxp3，CD127 and LAG-3 on CD4+T cells.

圖3 地塞米松影響自然調節性T細胞 (n=10) Fig.3 Effect of dexamethasone on regulatory T cells(n=10)Note: A.Flow analysis diagram of regulatory T cells;B.Dexamethasone reduced the Treg frequency.

圖4 地塞米松對Tr1細胞及Tr1/Treg細胞比率的影響(n=8)Fig.4 Effect of dexamethasone on Tr1 and ratio of Tr1/Treg cells (n=8)Note: A.Flow analysis diagram of regulatory Tr1;B.Dexamethasone increase Tr1 frequency;C.The ratio of Tr1/Treg cells increased.

2.2地塞米松體外短期處理改變CD4+T細胞表型 為了明確地塞米松處理后對CD4+T表型影響，我們分析了健康人外周血CD4+T細胞上CD127、CD25、LAG-3和Foxp3的表達情況(圖2)，我們發現地塞米松刺激后CD25和 Foxp3顯著降低(P值分別為P=0.006和P<0.0001)，而CD127和LAG-3顯著升高(P值分別為P<0.0001和P=0.011)，提示地塞米松處理改變CD4+T細胞的表型。

2.3地塞米松體外短期處理影響Treg和Tr1平衡 在本研究中我們發現，與對照組相比，地塞米松處理后Treg頻率顯著降低，如圖3 (P<0.0001)，而Tr1頻率增高，如圖4(P=0.051)，且Tr1/Treg細胞比率升高(P=0.044)，提示地塞米松改變Tr1/Treg細胞平衡。

3 討論

本研究發現，地塞米松短期體外處理增加CD4+T細胞頻率且呈劑量依賴性，降低CD4+T細胞上CD25和 Foxp3的表達，增加CD127和LAG-3表達；地塞米松處理顯著降低Treg，升高Tr1，且Tr1/Treg比率顯著增高。糖皮質激素短期處理改變Tr1/Treg細胞平衡。

CD4+輔助性T細胞具有可塑性，可分為多種亞類，包括Th1、Th2、Th17和最近確認的Th9、Th22以及與抗體產生有關的濾泡輔助性T細胞等。另一類具有免疫調節性的CD4+T細胞包括Treg,Tr1等。本研究顯示體外地塞米松處理增加CD4+T細胞頻率且呈劑量依賴性。Lim[1]發現不同劑量的地塞米松作用效果不一樣，低劑量的地塞米松使巨噬細胞功能增加，而大劑量的地塞米松對巨噬細胞功能具有免疫抑制性。陳艷等[19]的研究表明地塞米松對骨形成有抑制作用，且呈劑量依賴性。進一步研究地塞米松對CD4+T細胞的表型影響后發現，CD4+T細胞上的Foxp3和CD25表達顯著降低，表明糖皮質激素可能降低Treg頻率，結果與Pandolfi等[20]的研究一致。Wang等[18]用地塞米松處理過敏性哮喘小鼠，發現CD4+Foxp3+T細胞在體外實驗中增加，而Prado等[21]認為地塞米松增加Foxp3表達，但不增加其調節性活性。本研究還發現地塞米松體外處理后上調CD4+T細胞上CD127和LAG-3的表達,研究結果與Denis和Hai-Chon等一致[22-24]。

通過分析Foxp3和LAG-3分別為Treg和Tr1調節性T細胞典型標志物。地塞米松處理下調Foxp3而上調LAG-3表達，提示地塞米松可能會調節抑制性免疫細胞的平衡。結果分析表明：地塞米松處理后Treg顯著降低，Tr1細胞上調，且Tr1/Treg細胞比率顯著上調。可能是地塞米松短期處理促進或起始效應性CD4+T細胞分化為以Ⅰ型調節性T細胞為主的調節性T細胞，從而發揮免疫負調控作用。糖皮質激素治療后的反應性質依賴于刺激的持續時間和免疫系統的生理狀態。糖皮質激素在病理狀態下起抗炎分子的作用以控制病程；相反，在生理狀態下，糖皮質激素可能發揮了促炎作用[25]。這些結果提示，糖皮質激素可能主要誘導Ⅰ型調節性T細胞而發揮免疫調節作用。本研究由于是體外研究探討糖皮質激素對調節性T細胞數量的影響，具有一定的研究局限性。下一步有必要進一步探討地塞米松對調節性T細胞增殖與凋亡及功能的影響，并結合不同免疫性疾病對激素治療前后調節性T細胞分化與功能的研究。

地塞米松對免疫系統的作用是多效性的，且與治療時間和劑量相關。本研究探討了地塞米松對調節性T細胞Treg和Tr1的頻率及Tr1/Treg平衡的影響。本研究提示在臨床進行激素治療過程中，需明確不同疾病在激素治療后調節性T細胞的變化及對疾病進展與預后的影響，以便更好地了解激素的臨床適應癥。

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